非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)能导致家猪和野猪的出血热，强毒株致死率可达到100%。该病毒具有相当高的跨境传播能力，在非洲、欧洲、美洲和亚洲广泛流行。疫情对猪肉产业的影响严重，导致全球猪肉供需失衡及价格大幅波动，世界动物卫生组织(WOAH)将非洲猪瘟(ASF)列为法定报告动物疫病，我国也将之归入必须重点防范的一类动物疫病名录。近期，ASFV疫苗的研发和临床应用推广取得了一定进展，但要想彻底控制病毒传播仍需全球合作和共同努力[1,2,3]。

ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses, NCLDV),基因组长度为170～190 kb, 编码68种结构蛋白和超过100种非结构蛋白[4]。内膜蛋白p54与p30、p72被证实为最具抗原性和免疫原性的ASFV结构蛋白，能够诱导产生中和抗体[5]。针对p54的抗体最早出现在感染后第8 天，并持续存在数周，因此，p54及其抗体常被作为血清学诊断靶点，用于监测动物ASFV感染情况和免疫效力评估[6]。本研究将ASFV Pig/HLJ/2018毒株(GenBank号：MK333180)E183L(p54)基因的膜内区序列插入到pET-28a(+)载体，通过原核表达系统获得ASFV重组p54蛋白，借助杂交瘤技术制备出3株针对p54蛋白的单克隆抗体，并利用噬菌体展示肽库鉴定了3株抗体所识别的抗原表位，为ASFV诊断方法开发和病原学基础研究提供了生物学工具。

1、材料与方法

1.1 主要材料

携带ASFV Pig/HLJ/2018毒株E183L(p54)基因的质粒pGEX-4T-1-p54购自南京金斯瑞生物科技有限公司；ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)爬片和SDS-PAGE样品由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；ASFV阳性血清标准品购自中国兽医微生物菌种保藏中心；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV)、抗p30蛋白单克隆抗体、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由本实验室保存；BALB/c小鼠购自江苏华创信诺医药科技有限公司。

高保真PCR聚合酶Prime STAR、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Ladder、T4 DNA连接酶和DNA胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；pET-28a(+)载体由本实验室保存；质粒提取试剂盒购自Omega公司；感受态细胞DH5α和BL21(DE3)购自北京擎科生物技术有限公司；6×His-tag Ni亲和层析柱购于General Electric公司；250 kDa预染蛋白 Marker、12.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司；180 kDa预染蛋白 Marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高敏型ECL化学发光检测试剂盒购自南京诺唯赞医疗科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自PALL公司；HRP标记兔抗鼠IgG、FITC标记羊抗鼠IgG、His单克隆抗体、小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech公司；TMB底物和终止液购自碧云天生物技术有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT和HT培养基购自Sigma公司；Ph.D-12肽库试剂盒、抗M-13抗体购自NEB公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 重组质粒的构建与鉴定

实验室前期试验表明，全长的p54蛋白难以在原核系统中表达，因此选择对其进行截短表达。根据TMHMM-2.0的蛋白质跨膜区预测结果，针对p54蛋白的膜内区(157～555 bp, 53～183 aa)设计常规PCR引物，F:5′-TGACGGATCCATGTCTTCAAG-AAAGAAAAAAGC-3′(下划线处为BamHⅠ酶切位点),R:5′-TGACCTCGAGCAAGGAGTTTTCTAG-GTCT-3′(下划线处为XhoⅠ酶切位点),扩增产物长度为399 bp。以质粒pGEX-4T-1-p54为PCR模板。反应体系为：Prime STAR 25 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 20 μL。PCR反应条件为：98 ℃ 5 min; 98 ℃ 10 s, 55 ℃ 5 s, 72 ℃ 30 s, 共35个循环；72 ℃延伸5 min。通过胶回收方法纯化PCR产物。

将经过限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ处理后的目的片段和pET-28a(+)载体用T4连接酶连接8 h。之后转化连接产物到感受态细胞DH5α中，从菌液PCR鉴定为阳性的单克隆过夜培养物中提取质粒，对重组质粒进行限制性双酶切，阳性质粒由北京擎科生物技术有限公司测序。测序正确的重组质粒被命名为pET-28a-p54并于-20 ℃保存。

1.3 重组p54蛋白的原核表达、纯化及反应原性鉴定

将重组质粒pET-28a-p54转化到感受态细胞BL21(DE3)中，得到p54重组蛋白原核表达菌株p54-pET-28a-BL21。将p54-pET-28a-BL21的过夜培养物按体积比1∶100接种到含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37 ℃、200 r/min条件下培养至对数生长期，即菌液的OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,继续培养5～7 h后离心收集菌体。用PBS重悬菌体后在冰浴条件下进行超声破碎，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min。转移上清液到新的离心管，并用PBS重悬沉淀，分别制备SDS-PAGE样品，用以鉴定重组蛋白的表达形式。

使用His-tag镍离子亲和层析法纯化重组蛋白。在预试验中用梯度咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱，经SDS-PAGE测定重组蛋白的最佳洗脱浓度。后续试验洗脱时先用低咪唑浓度的除去杂蛋白，再用最佳浓度的缓冲液洗脱下重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。用透析法对纯化后的重组蛋白做脱盐和浓缩处理。用BCA法测定重组蛋白的浓度。通过Western blot鉴定重组蛋白与His单克隆抗体、ASFV阳性血清标准品的反应性。

1.4 p54蛋白单克隆抗体制备

1.4.1 动物免疫

将10只6周龄BALB/c雌性小鼠平均分为免疫组和阴性对照组。首次免疫时，以背部皮下多点注射方式给免疫组每只小鼠接种50 μg重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂的乳化物。首次免疫后的第3周进行第2次免疫，第4周进行第3次免疫。第2、3次免疫时将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂。整个免疫程序中，阴性对照组用等体积灭菌PBS处理。第3次免疫后7 d, 采集小鼠眼眶血，通过间接ELISA测定小鼠血清效价。细胞融合前3 d, 在效价达到1∶10 000的小鼠中选择数值最高的那只，腹腔注射100 μg重组蛋白。

1.4.2 单克隆抗体的制备

细胞融合前1 d, 分离小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，密度调整到1×105/mL,按100 μL每孔加入到96孔板中培养。处死经过4次免疫的小鼠，分离脾细胞，在PEG4000作用下与对数生长期的SP2/0细胞按照5∶1的比例进行细胞融合。将融合细胞用含1× HAT和20% FBS的选择培养基重悬，加入到含有饲养细胞的96孔细胞板中培养。细胞融合3 d后，每日观察细胞状态并统计融合率。细胞融合第5天后，每隔3 d用HAT选择培养基半换液。细胞融合第14天后，用HT补充培养基半换液，取出的一半细胞培养上清液用间接ELISA方法测抗体水平，对阳性杂交瘤细胞至少进行2～3次亚克隆至抗体阳性率达100%,确立杂交瘤细胞系并建库冻存，之后培养不再添加HT补充培养基。将阳性杂交瘤细胞连续传代培养和冻存，逐代减少FBS含量至10%、5%甚至无血清，以利于抗体产生和后续抗体纯化。测定不同代次的细胞培养物上清液中抗体效价，扩大培养能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，冻存于液氮中长期保存。

1.4.3 间接ELISA方法

用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L, pH=9.6)作为包被液将重组蛋白p54稀释到2 μg/mL,按100 μL/孔加入到酶标板，37 ℃孵育1 h。之后用PBST洗涤4次，最后一次洗涤完将酶标板在吸水纸上拍干。用5%脱脂乳作为封闭液，按100 μL/孔加入到酶标板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗涤。将阴性对照、阳性对照和样品，按100 μL/孔加入到酶标板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗涤。将HRP标记山羊抗鼠IgG单抗以1∶5 000比例稀释后，按100 μL/孔加入到酶标板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗涤。按100 μL/孔加入TMB显色液，37 ℃避光显色15 min。按100 μL/孔加入终止液。使用酶标仪读取OD450 nm值，待检样品OD450 nm/阴性样品OD450 nm(S/N)≥2.1时判定为阳性。以PBS处理组的小鼠血清作为阴性对照，免疫组小鼠血清作为阳性对照。

1.4.4 腹水制备

准备9只12周龄BALB/c雌性小鼠，按3只/株单克隆抗体分组。给每只小鼠腹腔注射0.5 mL经高压灭菌的液体石蜡。7 d后，给每只小鼠腹腔接种5×105个杂交瘤细胞。5～7 d后，每日观察小鼠状态，对腹部明显膨大、触摸有波动感的小鼠用0.55 mm静脉采血针收集腹水。采集到的腹水在4 ℃静置过夜，次日12 000 r/min离心5 min, 收集中间层，于-80 ℃保存备用。

1.5 p54蛋白单克隆抗体的生物学特性鉴定

1.5.1 Western blot鉴定单克隆抗体的反应性

取感染ASFV的PAM细胞裂解物，进行SDS-PAGE并转印到PVDF膜上，以杂交瘤细胞上清液作为一抗，进行Western blot反应性鉴定。设立未感染ASFV的PAM细胞作为阴性对照。

1.5.2 免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体的反应性

鉴定抗p54单克隆抗体与感染ASFV的PAM细胞的反应性，设立未感染ASFV的PAM细胞作为阴性对照。用4%多聚甲醛固定细胞，加入2% BSA在37 ℃封闭2 h, 以杂交瘤上清液作为一抗、HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗，在37 ℃各孵育1 h, 每个步骤之后用PBS洗涤3次。在荧光显微镜下观察并拍照。

1.5.3 单克隆抗体的反应特异性鉴定

取PRRSV、CSFV、JEV和ASFV感染的PAM细胞裂解物，进行SDS-PAGE并转印到PVDF膜上，以3株杂交瘤细胞上清液混合液作为一抗，进行Western blot反应特异性鉴定。

1.5.4 单克隆抗体的亚型鉴定

取建库的杂交瘤细胞上清液，使用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体的亚型进行鉴定，具体操作按照说明书执行。

1.5.5 单克隆抗体的B细胞表位鉴定

用Protein A/G PLUS-Agarose分别捕获腹水中未纯化的3株单克隆抗体，与10 μL噬菌体展示肽原始文库共同孵育，洗涤3次后洗脱下特异性结合的噬菌体，测定噬菌体滴度，完成第一次淘选。扩增上一次淘选收集的噬菌体并浓缩至滴度≥1.5×1012 pfu/mL,用于下一次淘选。第3次淘选后，从噬菌斑<100的滴度测定平板上各挑取30个单克隆进行间接ELISA鉴定。提取阳性噬菌体克隆的基因组，测序后翻译出展示肽序列，比对分析得到同一株单克隆抗体结合肽的共有序列，与p54蛋白氨基酸序列进行同源性分析，确定单克隆抗体识别的抗原表位。详细步骤参考Ph.D-12肽库试剂盒说明书。

2、结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定

p54蛋白膜内区基因(157～555 bp, 53～183 aa)的PCR扩增产物长度与预期的399 bp相符(图1A)。p54-pET-28a-DH5α重组菌的菌液PCR鉴定均为阳性(图1B)。重组质粒pET-28a-p54经过双酶切鉴定后获得的片段与目的基因大小一致(图1C)。基因测序结果显示，重组质粒的插入序列与目的基因完全一致。

图1 p54基因PCR扩增(A)、重组菌菌液PCR鉴定(B)和重组质粒酶切鉴定(C)   

2.2 重组p54蛋白表达、纯化及鉴定

SDS-PAGE结果显示，重组菌株p54-pET-28a-BL21经IPTG诱导后大量表达分子量约为23 kDa的融合蛋白，与预期大小相符，重组蛋白部分为可溶性表达，部分为包涵体形式(图2A)。通过His-tag镍离子亲和层析法纯化的可溶性p54重组蛋白在电泳后染色呈单一条带，纯化效果良好(图2B)。Western blot显示His单克隆抗体和ASFV阳性血清标准品均能特异性识别p54重组蛋白，表明p54重组蛋白成功表达且具有良好的反应原性(图3)。

2.3 单克隆抗体的制备

在小鼠第2次和第3次免疫后分别采集眼眶血，按本研究建立的ELISA方法测定小鼠血清抗体效价，结果显示，免疫组小鼠的抗p54蛋白抗体效价均达到1∶51 200,可用于细胞融合。

按本研究建立的ELISA方法对成功融合的杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆，最终获得3株能稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的细胞，分别命名为2A4、5F6和RH15。3株阳性杂交瘤细胞经过连续传代培养20代次以上，培养基上清液中抗体效价仍维持在1∶12 800的较高水平，表明其分泌抗体能力稳定。

每株抗p54蛋白单克隆抗体的细胞约收集到10 mL腹水，按照本研究建立的ELISA方法测定腹水体水平，效价均达到1∶5 120 000。

图2 SDS-PAGE鉴定重组蛋白p54的原核表达(A)及纯化效果(B)   

图3 Western blot鉴定重组蛋白p54与His单克隆抗体(A)及ASFV阳性血清(B)的反应性

2.4 单克隆抗体的反应性鉴定

Western blot结果表明，3株单克隆抗体能够特异性地识别感染ASFV的PAM细胞(图4A),而不与PRRSV、CSFV、JEV感染细胞裂解物发生反应(图4B)。

IFA表明，3株单克隆抗体能够识别感染ASFV的PAM细胞，产生特异性的红色荧光，荧光集中于ASFV感染细胞的病毒工厂区域。单克隆抗体不与阴性对照细胞发生反应(图5)。

2.5 单克隆抗体的亚型鉴定

结果见表1,3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类，轻链均为Kappa型。

图4 Western blot鉴定p54蛋白单克隆抗体与ASFV的反应性(A)及反应特异性(B)   

图5 IFA鉴定p54蛋白单克隆抗体与ASFV的反应性   

表1 p54蛋白单克隆抗体亚型鉴定

2.6 p54蛋白的抗原表位鉴定

2.6.1 液相淘洗的富集效果

经过4次淘洗，扩增后与扩增前的噬菌体滴度比值逐渐升高，回收率逐渐增大(表2),说明与单克隆抗体特异性结合的噬菌体得到了选择性富集。

表2 4轮筛选的噬菌体滴度和回收率

2.6.2 间接ELISA鉴定淘选

用间接ELISA鉴定第4次淘选得到的噬菌体。从第4次淘选产物滴度测定的LB/IPTG/X-gal平板中选择噬菌斑<100个的平板，每种单克隆抗体随机挑取出30个蓝色噬菌斑进行扩增，用于间接ELISA鉴定。结果显示，单克隆抗体2A4、5F6、RH15各有25、20、28个阳性噬菌体克隆(S/N≥2.1),这表明，经过4次淘选，能与3株单克隆抗体特异性结合的噬菌体得到有效富集。

图6 间接ELISA鉴定抗p54蛋白单克隆抗体与噬菌体克隆的结合  

2.6.3 氨基酸多序列比对分析

提取间接ELISA为阳性的噬菌体核酸进行测序，使用Expasy-Translate在线工具分析得到噬菌体展示的12肽序列，之后用NCBI Protein BLAST工具进行同源性分析，发现单克隆抗体2A4、5F6的噬菌体12肽共有序列为NTASQ,单抗RH15的噬菌体12肽共有序列为RQRNTYTHKDL。将这2段多肽序列与ASFV内膜蛋白p54蛋白的氨基酸序列作进一步比对，结果显示，单克隆抗体2A4、5F6筛选出的共有序列NTASQ与p54蛋白的157～161位氨基酸一致，单抗RH15筛选出的共有序列RQRNTYTHKDL则与p54蛋白的170～180位氨基酸一致，2段多肽序列与p54蛋白的一级结构有3个以上的连续氨基酸残基重合，说明3株单抗识别的抗原表位均为线性表位。

3、讨论

自2018年8月ASF在中国首次被报道以来，疫情迅速蔓延至全国，仅4个月已有21个省份受到波及，63.1万头生猪被扑杀。同时期，ASF在全球的流行也很活跃，包括俄罗斯、罗马尼亚、波兰在内的22个国家累计报告发生疫情5 800余起[7,8]。急性型ASF不仅致死率可高达100%,还具有极强的传播能力，严重打击了全球养猪业，引起猪肉市场价格的大幅波动。ASFV疫苗研制始于1960年，由于病毒具有遗传多变性、结构复杂等特点，对单核-巨噬细胞之外的非靶细胞适应性差，易发生生物学特性的改变，另外宿主免疫保护和病毒免疫逃避机制也尚不明晰，因此疫苗的研发进程较为缓慢[9,10,11]。2022年6月，首个商品化ASFV疫苗NAVET-ASFVAC在越南上市，该疫苗是由高毒力的ASFV Georgia 2007/1株缺失I177L基因后制备的减毒活疫苗，经评估能在强毒株感染后给生长育肥猪提供有效的免疫保护，阻断动物死亡并阻止经济损失[12]。不过，接种NAVET-ASFVAC的猪群存在严重的排毒现象，不能排除毒力返强、变异和基因整合等风险，疫苗对母猪群的安全性评价并不明确，现今该疫苗的应用范围仅局限于越南国内[12,13]。综上，由于缺乏有效的治疗药物和安全的且能够阻断病毒感染的疫苗，ASF的防治和净化策略仍侧重于生物安全措施、提升猪群自身免疫力、全面监测与精准清除[14,15]。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆所产生，能特异性识别单一抗原表位，被广泛地应用于生物学基础研究和临床治疗与诊断，如鉴定蛋白的表达与定位、靶向传递药物、阻断病原感染、富集和纯化生物制品、检测靶抗原等[16]。抗ASFV单克隆抗体的研制有助于加速解析病毒蛋白的结构与功能，探究病毒与宿主的相互作用和病毒的免疫逃避机制，从而更高效地筛选出抗病毒药物，有针对性地开发疫苗，同时为建立高特异、高灵敏性的血清学诊断方法提供材料[17]。在以往研究中，结构蛋白p30、p54、p72被证明在ASFV感染过程中表现出强抗原性，且针对这3种蛋白的抗体具有一定的中和活性，能够抑制病毒的黏附和内化[5]。遗憾的是，这3种蛋白并不足以引起完全的由抗体介导的体内中和作用，无法对不同毒株的感染产生有效的免疫保护，因此候选ASFV亚单位疫苗的应用局限性较大，仅仅能够延缓临床症状的出现时间和降低病毒血症水平[18]。不过在ASFV血清学诊断方面，这些蛋白仍然是相当重要的靶标[19,20]。

本研究通过原核表达系统成功表达了ASFV p54重组蛋白，免疫小鼠后使用杂交瘤技术制备单克隆抗体，经过间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。Western blot试验显示，3株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应；IFA试验也显示，3株单克隆抗体能够识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞，证明这3株单抗具有良好的反应性，可用于靶抗原的特异性检测。在IFA试验中可以看到，与作为阳性对照的抗p30蛋白单克隆抗体分布在胞浆中的弥散性点状荧光不同，本研究制备的3株单克隆抗体所识别的靶蛋白p54集中定位于靠近细胞核的病毒工厂中，呈致密的斑点状荧光，这一表现与以往关于ASFV结构蛋白定位的研究相符[21,22,23]。亚型鉴定试验显示，3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类，轻链均为Kappa型，提示后续抗体纯化如以腹水为来源材料时可能去除其中的自身免疫球蛋白(一般为IgG1和IgM)。通过噬菌体展示肽库筛选，确定了抗p54蛋白单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为157NTASQ161,该表位与p54蛋白的动力蛋白轻链(DYNLL1/DLC8)结合域151TTVTTQNTASQT162存在部分重合[24,25],后续将探究这2株单克隆抗体阻断此结合位点的潜力，以期为研究ASFV与宿主蛋白的相互作用提供精准的生物学工具。单克隆抗体RH15识别的抗原表位经鉴定为170RQRNTYTHKDL180,该表位目前未被免疫表位数据库(IEDB)收录，也未见有相关文章报道，这一结果丰富了p54蛋白的B细胞线性抗原表位信息，可为进一步解析ASFV结构蛋白的功能结构域和更有针对性地设计亚单位疫苗提供参考。

参考文献:

[11]雷建林,曹宏,杨丽霞,等.非洲猪瘟病毒的生物学特性与疫苗研制的难点[J].生物工程学报,2020,36(1):13-24.

[14]张涛,李红,BLOME S,等.非洲猪瘟的诊断和防治[J].国外畜牧学(猪与禽),2022,42(4):13-21.

[15]张洪亮,金铭,赵越,等.非洲猪瘟病毒免疫学及疫苗研究进展[J].病毒学报,2019,35(3):533-541.

基金资助:江苏省重点研发计划(现代农业)项目(BE2022394);

文章来源:陈艳,龙云凤,姜焱等.非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定[J].畜牧与兽医,2024,56(01):115-122.