猪链球菌(Streptococcus suis)引起猪链球菌病，不仅给养猪业造成巨大的经济损失[1,2],还可感染人引起肺炎、关节炎、脑膜炎等[3],严重危害人类健康。全球已有30多个国家报告有猪链球菌感染病例。1998年在我国江苏省S.suis感染造成了10万余头猪死亡，人群感染25例；2005年四川省S.suis感染造成了数千头猪死亡，人群感染208例[4]。目前，猪链球菌感染的治疗以抗菌药物为主，然而，随着抗菌药物不合理使用，猪链球菌耐药问题日益凸显[5]。当前面对细菌耐药性带来的挑战，全球主要的应对策略为加强耐药监测，合理使用抗菌药物，开发新型抗菌药物，联合用药增强抗菌作用[6]。新药的开发和实施是一个困难、耗时、昂贵的过程，并且新药研发的速度往往赶不上细菌耐药性变化的速度[7]。因此，寻找中草药类抗菌药物替代物是控制细菌耐药性持续发展的有效措施之一。

焦棓酸(分子质量为126.11,分子式为C6H6O3)是一种天然的多酚类化合物，提取自黄栌的茎，具有抑菌、抗炎、抗氧化及预防癌症、心血管疾病等活性[8,9]。焦棓酸还是一种还原剂，能够产生自由基，特别是超氧阴离子，例如，有研究表明，丙二醛活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性在用焦棓酸处理后得到增强[10]。Lu Z等[8]研究发现氧化损伤是焦棓酸抑制铜绿假单胞菌的重要机制，而DNA链和细胞膜是活性氧(reactive oxygen species, ROS)作用的2个靶点。Han Y等[11]发现加入不同浓度焦棓酸制备的抗菌膜，浓度越高，对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果越好。在当前“减抗限抗”的背景下，焦棓酸优良的抑菌作用使其有望成为抗菌药物替代物的候选物质，为感染性疾病防控提供新方法、新思路，也为研制抗菌药物提供物质基础和理论基础。

本研究发现了一种多酚类抑菌化合物焦棓酸，通过测定其对猪链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum inhibitory concentration, MBC)、时间-杀菌曲线、生物被膜形成的影响来探究焦棓酸的体外抗菌效果，进一步通过荧光定量PCR从转录水平分析焦棓酸对猪链球菌生长与生物被膜形成相关基因表达的影响，以期探究焦棓酸的抑菌机制，为猪链球菌感染的治疗提供科学依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验中所用的菌株猪链球菌2型HB菌株由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

焦棓酸，ChemFace公司产品；磷酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司产品；乙腈(色谱纯),安谱实验技术有限公司产品；磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑，上海麦克林生化科技有限公司产品；TSA培养基、TSB培养基，美国BD公司产品；MH培养基，海博生物技术有限公司产品；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；结晶紫，Biosharp公司产品；乙酸，国药集团化学试剂有限公司产品；细菌总RNA快速抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；HiScript® Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒，诺唯赞生物科技有限公司产品；2×TSINGKE® Master qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)试剂盒，北京擎科生物科技有限公司产品；本试验所用引物序列，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器

SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台，苏净安泰公司产品；恒温振荡器，苏州培英实验设备有限公司产品；立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博迅公司医疗设备厂产品；AUW120D型电子天平，日本岛津公司产品；微量可调移液器，德国Eppendorf公司产品；岛津液相色谱仪LC-20AT、液相色谱柱ODS-3(5 μm, 4.6×250 mm),日本岛津公司产品；酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司产品；罗氏LightCycler96 实时荧光定量PCR仪，Roche公司产品。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱法鉴定焦棓酸纯度

采用“醇提凝析”法提取分离焦棓酸后，用高效液相色谱测定样品含量[12]。色谱柱为岛津色谱柱ODS-3(5 μm, 4.6×250 mm),溶剂为0.07%甲醇，流速为1 mL/min, 检测波长为UV-210 nm, 柱温为35 ℃。配制对照品溶液(0.7 mg/mL),样品溶液(0.7 mg/mL)。吸取样品溶液5 μL进样分析，重复进样5次。流动相是质量分数为1 mL/L磷酸水溶液与纯乙腈的混合液[V(1 mL/L磷酸水溶液)∶V(乙腈)=95∶5]。

1.2.2 焦棓酸及其他药物母液的配制

用十万分之一电子天平准确称取适量药品，用纯水配制成浓度为16 384 μg/mL的母液，过滤除菌后置-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 焦棓酸及常用抗菌药物最小抑菌浓度、最小杀菌浓度测定

采用微量稀释法测定焦棓酸对猪链球菌HB菌株的MIC和MBC。用无菌接种环挑取纯化的猪链球菌2型HB菌株单菌落，充分分散于MH液体培养基，配置成5×105 CFU/mL的标准菌悬液；用MH液体培养基倍比稀释不同浓度的焦棓酸、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑溶液后，分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第10孔加化合物溶液，每孔50 μL,第11孔加MH液体培养基50 μL作为生长对照，第12孔只加MH液体培养基100 μL作为阴性对照。向第1至第11孔中加50 μL标准菌悬液，37 ℃孵育16～20 h, 焦棓酸浓度从低到高，第1个澄清孔的浓度为MIC值。吸取每孔菌液，涂布MH平板中，无菌落生长则为MBC值。

1.2.4 焦棓酸对猪链球菌的时间-杀菌曲线测定

用无菌接种环挑取纯化的猪链球菌2型HB菌株单菌落于TSB(5%小牛血清)中 37 ℃摇菌至对数期，按1∶100转接HB菌株菌液到5 mL TSB(含有5%血清)培养基中。第1组为未处理组(猪链球菌HB菌株)只有菌液，第2组为菌液中加入终浓度为MIC的焦棓酸(猪链球菌HB菌株+焦棓酸MIC),第3组为菌液中加入终浓度为MBC的焦棓酸(猪链球菌HB菌株+焦棓酸MBC),放入摇床于37 ℃、180 r/min培养12 h, 每隔1 h取200 μL样品检测OD 600 nm值及平板活菌计数。

1.2.5 焦棓酸对猪链球菌生物被膜形成的影响

分别从TSA(含有5%血清)平板上挑取单菌落至5 mL BHI培养基中，于37 ℃、180 r/min过夜摇菌。无菌条件下菌液与BHI液体培养基按1∶100的比例混合后，吸取2 mL加入到12孔板中，同时加入不同浓度的焦棓酸(MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC),对照组加入PBS,用菌液补全2 mL。37 ℃静置培养48 h后，弃去培养基，加入2 mL生理盐水润洗1遍后，弃去生理盐水，将生物膜烘干后加入1 mL 0.1%的结晶紫染液，染色15 mim后弃去染液，清水漂洗去多余的染液后烘干，观察生物膜形成状态，最后加入2 mL 33%乙酸溶解结晶紫染液，从每孔中取150 μL溶液用于OD 590 nm值的测定。

1.2.6 荧光定量PCR分析焦棓酸对猪链球菌相关基因表达的影响

摇菌至猪链球菌HB菌株生长到对数中期，加入MIC浓度的焦棓酸， 37 ℃进一步孵育12 h, 对照组加生理盐水。收集细菌，根据说明书，使用细菌总RNA快速抽提试剂盒提取RNA。采用HiScript® Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒，设计引物进行反转录成cDNA。反转录条件为50 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s。使用2×TSINGKE® Master qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)试剂盒进行荧光定量PCR试验。PCR条件为：95 ℃ 180 s; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环；最后进行熔解曲线分析。选择16S rRNA基因作为内参。所有试验都是重复3次。为了评估扩增的特异性，在每次PCR运行结束时绘制熔解曲线分析。用2-ΔΔCt法测定相对表达量。ΔΔCt=ΔCt(检测样本)-ΔCt(参考样本),ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。所用引物如表1。

表1 猪链球菌相关基因荧光定量PCR引物序列

1.2.7 数据分析

结果使用GraphPad Prism 8软件进行数据统计和差异分析(two-tailed, unpaired t-test),P>0.05为差异不显著， P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著( *为P<0.05, **为P<0.01),3次重复试验数据。

2、结果

2.1 焦棓酸的化学式及含量测定

采用高效液相色谱法对从黄栌中提取的焦棓酸进行了定量分析，焦棓酸的化学结构如图1所示。图2为焦棓酸浓度为0.07%时的色谱图。由图2和表2可知，出峰时间为8.088 min, 峰形窄而尖，分离度好，焦棓酸的纯度为99.794%。

图1 焦棓酸的化学结构   

图2 焦棓酸溶液(0.07%)色谱图  

表2 焦棓酸溶液(0.07%)峰值表

2.2 焦棓酸抑制猪链球菌的生长试验结果

按照1.2.3操作进行试验，在适当光线下观察96孔板，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)中的操作方法进行分析。焦棓酸对HB菌株的MIC为32 μg/mL,MBC值为64 μg/mL;磺胺异恶唑对HB菌株的MIC为1 024 μg/mL,MBC为2 048 μg/mL;磺胺甲恶唑对HB菌株的MIC为1 024 μg/mL,MBC为2 048 μg/mL(表3)。结果表明，猪链球菌HB菌株对焦棓酸敏感，而对磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑有一定程度的耐药。

2.3 焦棓酸对猪链球菌的杀菌作用呈剂量依赖性

对猪链球菌HB菌株OD 600 nm值和CFU计数的结果进行分析，发现使用MIC(32 μg/mL)与MBC(64 μg/mL)的焦棓酸处理猪链球菌HB菌株后，因生长抑制，其吸光度与阳性对照组相比差异显著(图3),且随着时间的推移，菌量在不断减少。MBC(64 μg/mL)的焦棓酸处理猪链球菌HB菌株8 h后，细菌被完全杀死(图4)。结果表明焦棓酸对猪链球菌HB菌株在体外有直接抑制和杀灭作用，且抑菌作用呈剂量依赖性。

表3 焦棓酸、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑对猪链球菌HB菌株的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度 coccus suis HB strain磺胺甲恶唑Sulfamethoxazole1 024 2 048

图3 焦棓酸对猪链球菌HB菌株生长曲线的影响  

图4 焦棓酸对猪链球菌HB菌株活菌计数的影响   

2.4 焦棓酸抑制猪链球菌生物被膜的形成

通过结晶紫(crystal violet, CV)法测定OD 590 nm值评价焦棓酸对猪链球菌HB菌株生物膜形成的影响。结果显示，1/2 MIC(16 μg/mL)和MIC(32 μg/mL)焦棓酸处理HB菌株后，与未处理组相比OD 590 nm值显著减弱；而1/8 MIC(4 μg/mL)和1/4MIC(8 μg/mL) 焦棓酸处理HB菌株后，与未处理组相比OD 590 nm值无显著变化(图5A和图5B), 提示焦棓酸在1/2MIC和MIC浓度下可以抑制猪链球菌HB菌株生物被膜的形成。

2.5 焦棓酸抑制猪链球菌生长、生物被膜形成及毒力相关基因的表达

通过RT-qPCR检测mrp、ccpA、luxS、gapdh、fbps、ftsZ、stK基因的表达水平。经焦棓酸处理后菌株生长相关基因ftsZ下调12.13倍、stK下调6.10倍，生物被膜形成相关基因luxS下调9.04倍，毒力相关基因gapdh下调17.91倍、fbps下调4.49倍、mrp下调17.66倍、ccpA下调22.85倍(图6)。结果表明，焦棓酸能够抑制猪链球菌生长、生物被膜形成及毒力相关基因的表达，本试验结果与生长试验、生物被膜测定试验结果一致。

3、讨论

据权威医学杂志《柳叶刀》报道，细菌感染已成为全球第二大死因，而细菌耐药性的产生无疑增加了治疗难度[13]。因此，研发针对细菌感染的中草药抗菌药物替代物是当务之急。本文以猪链球菌为研究对象，首先测定了HB菌株的耐药情况，发现其对磺胺类药物耐药严重，这与我国学者曾对临床分离的猪链球菌进行耐药分析，发现91.18%的菌株呈多重耐药， 82.3%～100.0%的菌株对磺胺类药物耐药的研究结果一致[14,15]。因此，亟需研发高效的中草药抗菌药物替代物。

生物被膜的形成是导致猪链球菌致病性和耐药性增加的主要原因之一[16]。生物被膜为细菌提供了保护屏障，帮助细菌抵抗外界的不利因素，促进自身的增殖。靶向干预猪链球菌生物被膜的形成是未来研发抗菌药物的重要策略。项目组前期筛选了大量多酚类化合物，发现焦棓酸对猪链球菌有较好的抑菌效果，并初步探讨其抑菌机制。试验结果发现，经MIC浓度的焦棓酸处理后，猪链球菌HB菌株的生长受到抑制，当焦棓酸浓度达到MBC时，HB菌株在8 h全被杀死。此外，焦棓酸在1/2 MIC即可抑制HB菌株生物被膜的形成。

图5 焦棓酸对猪链球菌HB菌株生物被膜形成的影响   

图6 焦棓酸对猪链球菌HB菌株相关基因表达的影响   

猪链球菌是一种人兽共患病病原菌，对养殖业与公共卫生影响重大。近年来，大量毒力因子被检测出来，部分毒力因子已被证实参与猪链球菌感染与发病过程[17,18]。为了解释焦棓酸抑菌的深层次原因，我们进行了荧光定量PCR试验，研究焦棓酸对猪链球菌生长、侵入、定植等毒力因子的影响，发现经焦棓酸处理后，猪链球菌毒性相关基因mrp、ccpA、gapdh、fbps,生物被膜相关基因luxS,生长相关基因ftsZ、stK表达显著下调。据此推测，焦棓酸可能是通过下调这些基因表达来抑制猪链球菌的生长和生物被膜的形成。

综上所述，焦棓酸凭借其优越的抗菌活性，可作为治疗猪链球菌感染的候选药物。未来需要关注的是焦棓酸体内的抑菌效果以及挖掘焦棓酸作用于猪链球菌的靶标。

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[18]林玲,李春玲,臧莹安,等.猪链球菌毒力因子研究进展[J].动物医学进展,2020,41(9):82-86.

基金资助:国家重点研发计划项目(2021YFD1800401);国家自然科学基金项目(31802189);湖北省重点研发计划项目(2022BBA0055);湖北省科技重大专项项目(2021ABA005);湖北省自然科学基金创新群体项目(2021CFA019);湖北省农业科技创新中心项目(2021-620-000-001-017);

文章来源:高婷,王艳君,王雅雯,等.焦棓酸对猪链球菌体外抑菌效果试验[J].动物医学进展,2024,45(07):76-81.