人皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)是所有皮肤恶性肿瘤中最具侵袭性的类型[1]。对于局限性病变，手术是最推荐的治疗方式，一旦发生侵袭性播散，必须同时提供其他形式的治疗(如化疗、免疫治疗、靶向治疗和放疗)[2,3,4]。由于存在耐药、远处转移和高复发率等因素，SKCM患者的总体预后仍然较差，因此，需要寻找更多具有预后和治疗意义的特异性分子生物标志物。丝氨酸羟甲基转移酶2(serine hydroxymethyltransferase 2,SHMT2)存在于线粒体中，是一碳代谢循环中必不可少的酶，负责产生一碳单位[5]。最近的研究表明，SHMT2参与DNA修复、RNA翻译、表观遗传改变和氧化还原防御[6]。SHMT2在多种癌症中显著上调，包括结直肠癌、胶质瘤、肾癌和膀胱癌[7,8]。临床研究也表明，SHMT2高表达与肿瘤侵袭和预后密切相关[9]。因此，SHMT2有望成为肿瘤代谢重编程的重要靶点。但是关于SHMT2能否参与人皮肤黑色素瘤细胞的迁移及侵袭仍不清楚。因此，本研究通过观察SHMT2对人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35迁移和侵袭等生物学行为的影响，探讨SHMT2促进人皮肤黑色素瘤细胞迁移和侵袭的分子机制。

1、材料与方法

1.1 材料

人皮肤黑色素瘤细胞系WM35和A-375购自ATCC。质粒表达载体CMV-SHMT2-EGFP-SV40-puromycin购自上海吉凯基因生物有限公司。DMEM培养基和胎牛血清购于上海源培生物科技有限公司，SHMT2(#33443)和 Akt1(#2938)抗体购于 Cell Signaling Technology公司GAPDH(sc-47724)和p-Akt1(sc-293125)抗体购于Santa Cruz公司，嘌呤霉素(540411)购于Sigma-Aldrich公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 嘌呤霉素压力筛选获 取稳定表达SHMT2 蛋白的A-375和WM35细胞系

人皮肤黑色素瘤细胞系WM35培养于RPMI 1640培养基(10%胎牛血清),A-375培养于DMEM培养基(10%胎牛血清),于5%CO2的37 ℃孵箱中进行常规培养。分别将1×105的A-375细胞和WM35接种于6孔板中，培养至细胞汇合度为70%～80%。将2 μg SHMT2重组质粒DNA和对照质粒DNA分别与Lipofectamine2000脂质体转染试剂混合后，转染于A-375细胞和WM35细胞中(转染步骤参照脂质体转染试剂说明书)。转染24 h后，将上述细胞按照1∶10的稀释比例接种于100 mm细胞培养皿中，待细胞贴壁后，更换为含有嘌呤霉素(20 μg/mL)的DMEM培养基和含有嘌呤霉素(15 μg/mL)的RPMI 1640培养基进行压力筛选，2～3周后，挑取单克隆细胞至24孔板中进行扩增培养。随后提取细胞总蛋白，通过Western Blotting实验，鉴定稳定表达SHMT2的A-375-SHMT2和WM35-SHMT2细胞株及对应的对照细胞株(A-375-GFP和WM35-GFP)。

1.2.2 细胞免疫化学

各组细胞使用胰酶消化后制备成细胞悬液接种于玻璃爬片上(0.5 cm×0.5 cm),待细胞贴壁且细胞汇合 度至70%左右后依次进行如下操作：PBS液体洗涤5 min×3次；4%多聚甲醛室温固定30 min; PBS洗涤5 min×3次；0.2% TritonX-100室温放置10 min; PBS洗涤5 min×3次；滴加一抗4 ℃湿盒过夜；次日室温放置30 min; PBS 洗涤5 min×3次；二抗室温放置30 min; PBS洗涤5 min×3次；DAB显色；苏木素染色2 min; 盐酸酒精分化15 s; 氨水反蓝60 s; 梯度酒精脱水各5 min; 二甲苯透明2 min; 中性树胶封片；光学显微镜下观察。

1.2.3 Western Blotting

各组细胞使用细胞裂解液收集细胞蛋白，测定蛋白浓度。Western Blotting实验步骤简述如下：将蛋白样本与蛋白质分子量标准分别上样于加样孔；SDS-PAGE分离蛋白；转膜；将膜移至含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1 h; TBST洗膜10 min×4次；一抗4 ℃孵育过夜；次日，TBST洗膜10 min×4次；二抗室温孵育1 h; TBST洗膜10 min×4次；化学发光检测液进行发光反应；通过Western Blotting化学发光成像一体机拍照分析。

1.2.4 Transwell体外迁移实验

将各组细胞使用无血清DMEM培养基或者RPMI 1640培养基培养24 h后通过胰酶制备成细胞悬液，PBS清洗1遍。在Transwell下室中加入800 μL含10% FBS的DMEM培养基或者RPMI 1640培养基，在Transwell上室中加入200 μL的细 胞悬液(细胞数 量为4×104),置于含5%CO2的37 ℃孵箱中进行孵育。48 h后，用棉签将上室内底部残留的细胞擦去，甲醛固定10 min, 0.1%的结晶紫室温孵育10 min, PBS清洗3次，小室底面朝上，在显微镜下拍照观察。随机选取5～10个视野进行计数，进行统计分析。

1.2.5 Transwell体外侵袭实验

将各组细胞使用无血清DMEM培养基或者RPMI 1640培养基培养24 h后通过胰酶制备成细胞悬液，PBS清洗1遍。将Matrigel胶按照1∶5的比例稀释后加于Transwell上室(80 μL),待Matrigel胶凝固后，在Transwell下室中加入800 μL含10% FBS的DMEM培养基或者RPMI 1640培养基，在Transwell上室中加入200 μL的细胞悬液(细胞数量为8×104),置于含5%CO2的37 ℃孵箱中进行孵育。48 h后，用棉签将上室内底部残留的细胞擦去，甲醛固定10 min, 0.1%的结晶紫室温孵育10 min, PBS清洗3次，小室底面朝上，在显微镜下拍照观察。随机选取5～10个视野进行计数，进行统计分析。

1.2.6 细胞划痕实验

将各组细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度大于95%后，用20 μL无菌枪头以横、纵方向各划三条平行横线，PBS洗涤×3次，更换为无血清的DMEM培养基，用倒置显微镜对划痕进行观察、拍照。培养48 h后，再次使用倒置显微镜对划痕进行观察及拍照。选取5个视野进行统计分析。

1.2.7 通过GEPIA在线数据库分析SHMT2在SKCM患者组织中与多种靶分子表达的相关性

在线数据库网址为：gepia.cancer-pku.cn, 使用其差异基因表达分析功能，分析SHMT2在SKCM患者组织中，与EMT相关因子Snai1、Snai2、ZEB2、vimentin及Akt1表达的相关性。

1.2.8 Real-time PCR检测细胞mRNA表达

细胞总RNA使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific公司)进行提取，按照反转录试剂盒说明书(Thermo Fisher Scientific公司)将RNA反转录成cDNA,以NCBI Gene bank提供的人基因序列为模板设计特异性Real-time PCR引物(表1)。Real-Time PCR按照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ说明书(Takara公司)进行。将各管混匀离心后，置于Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪中进行扩增反应。每个样品准备3个复管，试验至少重复3遍。

表1 Real-time PCR引物列表

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0进行数据的统计学分析，实验数据结果均以均数±标准差

表示，多组样本间的均数比较采用单因素方差分析，两组样本间的均数比较采用t检验，P<0.05具有统计学差异。

2、结果

2.1 成功构建稳定表达SHMT2蛋白的A-375和WM35细胞系

Western Blotting结果显示，经过嘌呤霉素 压力筛选后，成功获得了稳定表 达SHMT2蛋白的A-375-SHMT2-3、A-375-SHMT2-5、WM35-SHMT2-1、WM35-SHMT2-7 及对照细胞 A-375-GFP-1、A-375-GFP-2、WM35-GFP-1、WM35-GFP-2(图1A,C)。免疫细胞化学的结果显示，A-375-SHMT2-3、A-375-SHMT2-5、WM35-SHMT2-1、WM35-SHMT2-7细胞中SHMT2蛋白表达量明显高于对照细胞(图1B,D)。

2.2 SHMT2促进A-375和WM35细胞体外迁移和侵袭的能力

Transwell体外迁移实验结果显示，在A-375 细胞中过表达SHMT2后，每个视野下穿过Transwell小室的细 胞数量为(84.60±5.23),多于对照细胞(A-375-GFP)的(45.80±8.63)(P=0.003 2),见图2A;在WM35细胞中过表达SHMT2后，每个视野下穿过Transwell小室的细胞数量为(76.40±8.51),多于对照细胞(WM35-GFP)的(31.80±6.54)(P=0.000 2),见图2C。Transwell体外侵袭实验结果表明，在A-375细胞中过表达SHMT2后，每个视野下穿过Transwell小室的细胞数量为(34.60±5.18),多于对照细胞(A-375-GFP)的(14.40±2.41)(P=0.001),见图2B;在WM35细胞中过表达SHMT2后，每个视野下穿过Transwell小室的细胞数量为(29.00±4.95),多于对照细胞(WM35-GFP)的(13.20±3.86)(P=0.000 1),见图2D。上述结果显示SHMT2可以增强人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35体外迁移和侵袭的能力。

图1 SHMT2稳定表达细胞株鉴定

Western Blotting检测SHMT2在稳定转染细胞系A-375(A)和WM35(C)细胞中的表达；细胞免疫组织化学检测SHMT2在稳定转染细胞系A-375(B)和WM35(D)细胞中的表达。

图2 SHMT2增强人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35体外迁移和侵袭的能力

Transwell小室实验检测A-375-GFP和A-375-SHMT2细胞迁移(A)和侵袭(B)能力，并进行定量 分析。Transwell小室实 验检测WM35-GFP 和 WM35-SHMT2细胞迁移(C)和侵袭(D)能力，并进行定量分析(结晶紫染色)。**P<0.01。

2.3 SHMT2促进A-375和WM35细胞的划痕愈合能力

细胞划痕实验的结果显示，细胞划痕48 h时后，A-375-SHMT2中细胞划痕的愈合速度明显快于A-375-GFP细胞(P=0.006 6),见图3A。同 样的，细胞划痕48 h时后，WM35-SHMT2中细胞划 痕的愈合速度明显快于WM35-GFP细胞(P=0.003 9),见图3B。

图3 SHMT2促进人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35的划痕愈合(n=3)

A:细胞划痕实验检测SHMT2对A-375细胞迁移能力的影响；B:细胞划痕实验检测SHMT2对WM35细胞迁移能力的影响。 *P<0.05。

2.4 SHMT2上调Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin在A-375和WM35细胞中的表达

GEPIA在线数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn)的结果证实，在人皮肤黑色素瘤中，SHMT2表达与Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin表达呈正相关(图4A)。实时荧光定量PCR的结果显示，在A-375(图4B)和WM35(图4C)细胞中过表达SHMT2可以上调Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin的表达。

图4 SHMT2上调EMT相关因子在A-375和WM35细胞中的表达

A:GEPIA在线数据库证实SKMC中SHMT2与Snai1、Snai2、ZEB2、vimentin表达呈正相关；B:RT-PCR检测A-375-GFP和A-375-SHMT2细胞中Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin的表达；C:RT-PCR检测WM35-GFP和WM35-SHMT2细胞中Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin的表达。*P<0.05,**P<0.01。

2.5 SHMT2上调Akt1和p-Akt1在A-375和WM35细胞中的表达

GEPIA在线数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn)的结果证实，在人皮肤黑色素瘤中，SHMT2表达与Akt1表达呈正相关(图5A)。实时荧光定量PCR的结果显示，在A-375(图5B)和WM35(图5C)细胞中过表达SHMT2可以上调Akt1的表达。Western Blotting检测结果证实，在A-375和WM35细胞中过表达SHMT2可以上调Akt1和p-Akt1的表达(图5D-E)。

图5 SHMT2上调Akt1和p-Akt1在A-375和WM35细胞中的表达

A:GEPIA在线数据库证实在SKMC中SHMT2和Akt1的表达呈正相关；B:RT-PCR检测Akt1和p-Akt1在A-375(B)和WM35(C)细胞中的表达；Western Blotting检测A-375(D)和WM35(E)细胞中Akt1的表达。*P<0.05。

3、讨论

由于具有高转移率、高侵袭性及发病率逐年增加等特征，SKCM被认为是全球最致命的皮肤恶性肿瘤之一[10]。SHMT2在大多数恶性肿瘤中作为反映细胞一种非生理性的氧应激状态而普遍存在，因此其在缺氧中的重要性得到了广泛研究。缺氧与许多肿瘤标志相关，如细胞增殖、血管生成、代谢重编程、辐射抗性等，还可诱导晚期肿瘤细胞发生EMT和ROS表型，从而促进细胞侵袭和转移[11]。在结直肠癌中，SHMT2通过抑制β-catenin的降解促进结直肠癌细胞的进展和转移，可以作为结直肠癌的潜在治疗靶点和生存预测因子[12]。在口腔鳞状细胞癌中，沉默SHMT2表达后，可以抑制口腔鳞状细胞癌细胞的活力、迁移、侵袭及EMT[13]。本研究中，细胞划痕愈合实验的结果显示，在A-375和WM35细胞中过表达SHMT2可以显著促进细胞划痕愈合的速度，Tranwell小室实验也证实SHMT2可以显著增强A-375和WM35细胞体外迁移及侵袭的能力。GEPIA在线数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn)的结果显示，在SKCM患者组织中，SHMT2表达与EMT相关因子呈正相关(Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin)。本研究中，在A-375和WM35细胞中过表达SHMT2可以显著上调EMT相关因子的表达，如Snai1、Snai2、ZEB2和vimentin。这些结果证实SHMT2通过促进人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35的上皮-间充质转换，增强细胞体外迁移及侵袭的能力，这一结果与SHMT2在其它肿瘤中促进细胞迁移和侵袭的作用是一致的。

Akt通路在细胞代谢、增殖、生长和死亡等不同的细胞过程中发挥着独特的作用，在促进细胞存活和抑制细胞凋亡方面发挥着不可或缺的作用，被称为“存活激酶”[14]。虽然PI3K/Akt通路在正常细胞中受到严格调控，但在癌细胞中却被解除调控，导致细胞增殖、生长和存活增强，并对细胞凋亡产生抗性[15,16]。除了促进细胞存活和增殖的作用外，Akt1还参与癌细胞的迁移和侵袭，在癌症进展和转移中发挥重要作用[17]。在软组织肉瘤中，肿瘤细胞的迁移和侵袭主要由Akt1控制，沉默Akt1可以降低与侵袭性癌症相关的特异性上皮-间充质转化(EMT)标志物如vimentin的表达[18,19]。在前列腺癌中，Akt1通过激活整合素可以促进细胞的运动、侵袭和跨内皮迁移，上调EMT标志物如N-cadherin, Snai1[20,21]。GEPIA在线数据库(http: //gepia.cancer-pku.cn)结果显示，在SKCM患者组织中，SHMT2表达与Akt1呈正相关。在本研究中，在A-375和WM35细胞中过表达SHMT2可以显著上调Akt1和p-Akt1的表达。

综上所述，本研究发现SHMT2可以促进人皮肤黑色素瘤细胞A-375和WM35的体外迁移和侵袭，其作用可能是通过激活Akt1/p-Akt促进细胞上皮-间充质转换实现的，上述结果可能为研究SHMT2调节人皮肤黑色素瘤细胞迁移和侵袭的分子机制提供一些新的思路。

参考文献:

[4]任宇,刘宝瑞,邹征云.晚期恶性黑色素瘤的靶向及免疫治疗研究进展[J].现代肿瘤医学,2018,26(12):1970-1974.

[16]徐利本,吴朝阳,王远东.PI3K/Akt信号传导通路在肿瘤发生发展及治疗中的作用 [J].现代肿瘤医学,2021,29(01):177-180.

[20]冯倩,刘宪,张妮,等.HK2通过Wnt/β-catenin信号通路上调Cyclin D1､MMP7和Slug表达促进宫颈癌细胞增殖和迁移[J].肿瘤防治研究,2020,47(9):649-654.

[21]王蕾,刘宪,张燕茹,等.HK2通过Akt1/p-Akt1上调Cdc42表达促进宫颈癌细胞迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2022,30(11):1931-1936.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:82100083); 四川中医药高等专科学校资助项目(编号:23ZRYB18); 陕西省卫生厅扶植项目(编号:2021D045);

文章来源:夏艳,曹远均,夏苗,等.SHMT2通过上调Akt1促进人皮肤黑色素瘤细胞的迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2328-2334.