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ssc-miR-196a靶向PPARGC1A基因影响猪骨骼肌发育

2024-07-19 54 上传者：管理员

摘要：该研究运用miRsystem和MiRWalk 2个在线软件筛选与PPARGC1A基因具有潜在调控关系的microRNA；构建psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-WT和psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-MUT双荧光素酶报告载体，并检测候选microRNA与PPARGC1A基因间的靶向调控关系。结果显示，ssc-miR-196a与PPARGC1A基因具有潜在的调控关系，ssc-miR-196a可与PPARGC1A 3’UTR区结合并显著降低细胞中荧光素酶的活性（P<0.01）,ssc-miR-196a在金华猪90日龄和180日龄背最长肌中的表达水平略高于大白猪，ssc-miR-196a在180日龄猪背最长肌中表达水平显著高于30日龄和90日龄（P<0.05）。ssc-miR-196a靶向结合PPARGC1A基因3’UTR，为进一步开展microRNA介导PPARGC1A基因调控猪骨骼肌发育方面的研究提供参考。

关键词：
PPARGC1A
ssc-miR-196a
猪生长
猪骨骼肌发育
背最长肌
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过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PPARGC1A）基因广泛表达于动物机体的各种器官和组织中[1]，尤其在富含线粒体的骨骼肌中高表达[2,3]，可参体内碳水化合物和脂肪代谢过程的调节[4]，并对肌肉组织发育具有重要的调控作用。miRNAs广泛参与调节肌肉发育过程[5,6,7,8]。miR-196a可通过脂肪细胞因子信号通路调节猪背最长肌中脂肪组织的沉积[9]。目前，关于ssc-miR-196a是否能够靶向PPARGC1A调节猪肌肉组织的发育的研究鲜少见。因此，本研究通过筛选靶向PPARGC1A基因的miRNA，并验证miRNA与PPARGC1A基因间的靶向调控关系，为改善猪生长、肉质性状提供理论基础。

1、材料与方法

1.1 试验动物

大白猪、金华猪饲养环境一致，配合饲料进行饲养，自由采食、饮水和活动。屠宰30、90、180日龄大白猪和金华猪，取其背最长肌，装入无RNA酶冻存管内，并放入液氮中保存备用。

1.2 miRNA的预测和筛选

用miRsystem(http://mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/）和MiRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）2个在线软件预测可能靶向调控PPARGC1A基因的miRNAs，取2个软件预测结果交集作为候选miRNAs，用于后期miRNA-靶基因验证研究。

1.3 RNA提取、cDNA合成和PCR扩增、重组质粒构建

RNA提取、cDNA合成和PCR扩增参照王伟[10]。根据GenBank中猪PPARGC 1A基因（NM＿213963.2)mRNA序列设计引物（引物序列为F:TGGAACATTATGGGCACTCA,R:AACCTGTTTGCTCTATGTCGTG）扩增PPARGC 1A-3’UTR片段，并将PPARGC1A-3’UTR片段插入到psiCHECK2载体的PmeI/XhoI酶切位点以构建野生型载体psiCHECK2-PPARGC 1A-3’UTR-WT（图1），对野生型载体进行点突变以构建突变型载体psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-MUT（图2）。

1.4 细胞转染和双荧光素酶活性的检测

方法参照吴玲玲[11]、郑美丽等[12]。

图1 野生型载体PPARGC1A 3’UTR部分序列（miRNA结合位点用加粗下划线标注）

图2 突变型载体PPARGC1A 3’UTR部分序列（突变的碱基以加粗下划线显示）

1.5 统计分析

用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，t检验进行2组间显著性分析，单因素方差检验多组数据间显著性分析，差异显著性标准为P<0.05。所有试验都至少重复3次。

2、结果

2.1 调控PPARGC1A基因的miRNA预测

分别用miRsystem和MiRWalk 2个在线软件预测调控PPARGC1A的miRNA，结果显示，miRsystem在线软件预测到349个miRNA,MiRWalk在线软件预测得到2 054个，聚焦2个在线软件的预测得到共同的miRNA有248个，结合实验室前期测序数据，发现miR-196a为猪保守性结合的miRNA且miR-196a与PPARGC1A3’UTR序列互补配对，miR-196a种子序列与PPARGC1A 3’UTR结合区域（图3A），二者形成的RNA双链自由能为-13 kJ/mol（图3B），以上结果表明PPARGC1A 3’UTR与miR-196a具有相互作用。

图3 miR-196a与PPARGC1A靶位点分析

2.2 ssc-miR-196a靶向结合PPARGC1A 3’UTR降低双荧光素酶活性

为检测预测得到的miR-196a与PPARGC1A之间的靶向结合关系，设计引物扩增猪PPARGC1A 3’UTR序列并将其连接到psiCHECK2载体上，构建psiCHECK2-PPARGC 1A-3’UTR质粒（图1）。将psiCHECK2-PPARGC 1A-3’UTR质粒与miR-196a mimic共转染至293T细胞，双荧光素酶报告系统检测结果表明，转染miR-196a的细胞其荧光素酶活性显著降低（P<0.01）（图4）；为进一步验证miR-196a与PPARGC 1A-3’UTR的特异性结合，对以上野生型载体进行点突变以构建突变型载体psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-MUT（图2），共转染试验结果显示，转染miR-196a的细胞其荧光素酶活性差异不显著（P>0.05）。以上试验结果表明，ssc-miR-196a可特异性结合PPARGC1A的3'UTR。

图4 ssc-miR-196a靶向PPARGC1A的双荧光素酶活性测定

2.3 ssc-miR-196a在大白猪和金华猪背最长肌不同发育阶段的表达模式分析

采集30、90、180日龄大白猪和金华猪的背最长肌组织，检测不同品种猪背最长肌组织以及不同发育阶段背最长肌组织中ssc-miR-196a的表达水平。结果显示，ssc-miR-196a在金华猪90日龄和180日龄背最长肌组织中的表达水平略高于大白猪，并且ssc-miR-196a在180日龄猪背最长肌中表达水平显著高于30日龄和90日龄（P<0.05）（图5），但ssc-miR-196a在两品种猪相同日龄背最长肌组织中表达差异不显著（P>0.05）。以上结果表明，ssc-miR-196a在猪背最长肌不同发育阶段的表达模式呈现显著差异。

图5 ssc-miR-196a在大白猪和金华猪背最长肌不同发育阶段的表达模式

注：相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。

3、讨论

PPARGC 1A基因是线粒体生物发生和抗氧化能力等功能的调节剂，可编码许多核受体家族的

多功能共激活因子，并参与脂肪酸代谢、调节葡萄糖、刺激线粒体生物发生和肌纤维类型形成[13]。miRNA在猪骨骼肌生长发育过程发挥着重要作用，如miR-16[5]、miR-27a[14]等，然而PPARGC1A基因在猪骨骼肌发育和肉品质调控中的表达是否受miRNA的调控鲜有报道。

本研究初筛选调控猪PPARGC1A基因的miRNA，发现ss-miR-196a为猪保守性结合的miRNA且ssc-miR-196a与PPARGC 1A 3’UTR序列互补配对，双荧光酶检测ssc-miR-196a可能与PPARGC1A 3’UTR特异性结合，突变型载体构建和共转染试验表明ssc-miR-196a可与PPARGC1A 3’UTR特异性结合。ssc-miR-196a在脂肪沉积量高的金华猪90日龄和180日龄背最长肌中的表达水平都略高于瘦肉型大白猪，这与Liu L等[9]在大约克夏和中国皖南花猪中的研究结果一致，其表达量越高则个体瘦肉率越低。因此，推测ssc-miR-196a可靶向结合PPARGC1A基因调控猪骨骼肌的发育。

4、结论

本研究成功构建psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-WT和psiCHECK2-PPARGC1A-3’UTR-MUT 2种载体，鉴定了ssc-miR-196a对PPARGC1A基因的靶向调控作用，检测到ssc-miR-196a不同月龄的金华猪、大白猪背最长肌表达模式呈现显著差异，为进一步开展miRNA调控猪PPARGC1A基因影响猪肉产量和肉品质的研究提供参考。

参考文献:

[10]王伟,滚双宝,王鹏飞,等.猪miR-204组织表达与重要靶基因筛选[J].浙江农业学报,2020,32(9):1 564-1 573.

[11]吴玲玲,张小玉,李晓,等.miR-196b-5p促进成肌细胞增殖分化[J].遗传,2023,45(5):435-446.

[12]郑美丽,许桥,王晓凤,等.ssc-miR-181a靶基因ESM 1与猪肌肉生长的关系研究[J].中国畜牧杂志,2023,59(6):125-130.

基金资助:河北省自然科学基金(C2021402038); 国家科技重大专项:转基因生物新品种培育(2018ZX0800928B); 云南省农业联合专项(202101BD070001-103);

文章来源:张展境,李淑怡,张瑞,等.ssc-miR-196a靶向PPARGC1A基因影响猪骨骼肌发育[J].现代畜牧科技,2024,(07):78-81.