摘要:目的 探究河豚毒素(TTX)暴露对小鼠小胶质细胞BV-2的氧化应激损伤的诱导作用。方法 选择BV-2细胞进行TTX体外暴露。首先采用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol•L-1)TTX对BV-2细胞进行单独暴露,观察细胞形态和活力变化,利用CCK8法确定TTX联合暴露浓度。使用藜芦定(VTD)和毒毛旋花苷G(O)的混合物与TTX对BV-2细胞进行联合暴露,根据细胞形态和细胞活力验证BV-2细胞膜上离子通道类型。通过测定TTX单独暴露后乳酸脱氢酶(LDH)释放量、钙离子荧光量、活性氧(ROS)含量和细胞凋亡率水平,分析TTX暴露对BV-2细胞的影响。结果 100μmol•L-1 TTX可改变BV-2细胞形态,抑制细胞活力。联合暴露情况下,TTX能够拮抗VTD和O混合物造成的细胞膜内外钠离子浓度差异,延缓细胞损伤状态。与对照组比较,100μmol•L-1 TTX可促使细胞膜通透性改变,释放4.01 U/g LDH。在100μmol•L-1 TTX暴露下分别升高细胞内钙离子和ROS水平,细胞相对荧光强度提升至84.78%和63.48%;100μmol•L-1 TTX暴露下,BV-2细胞凋亡率增加2.9倍。结论 TTX暴露可以抑制BV-2细胞增殖能力,改变细胞膜的通透性,促使ROS在细胞内蓄积,诱导细胞氧化应激损伤,造成细胞凋亡。
河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)是一种天然存在的神经毒素,最初从河豚鱼的卵巢中分离纯化并命名,之后研究人员相继从蝾螈[1]、斑纹胸膜鳃鱼[2]、蓝环章鱼[3]、海洋蠕虫[4]等生物体内检测出TTX。TTX在生物体内具有相似的毒性水平和分布规律[5]。2005年前,TTX主要局限于东南亚附近温暖海域的生物体内,伴随全球变暖、运输行业发展、人类活动轨迹多样化等事件的影响,毒素已经逐渐扩散到太平洋[6]、地中海[7]、大西洋[8]等地区的生物中。TTX的分布范围更加广阔,富集污染的能力大大提升,对生态环境和公共卫生造成不容忽视的安全隐患[9]。TTX的结构性质稳定,人类传统的腌制、日晒、高温烹饪加工均不能去除其毒性。TTX毒性是氰化物的1 200倍,人体致死量仅为1.5~2.0 mg/kg,相当于血液水平9 ng/mL[10],尚无特效解毒剂。TTX可以通过胃肠道被人体吸收,进入循环系统并输送到全身,可浸润脑脊液,通过尿液排泄[11]。食用低剂量TTX污染的食物可导致皮肤刺痛或感觉异常。当食用或吸收较大剂量后,TTX通过血液循环在体内迅速扩散,导致全身肌肉麻痹、心律失常、呼吸衰竭[12]。TTX本身无色无味,肉眼难以察觉,中毒潜伏期极短,如果不能及时改善中毒状况,将造成神经元和肌肉快速失活,致死率极高,是当前国际公认的生物战剂之一[13],对人们的健康构成严重威胁。
电压门控Na+通道(voltage-gated sodium channel, VGSC)是由α和β亚基构成的跨膜糖蛋白[14],广泛分布于神经元等可兴奋的细胞膜上,是大脑和中枢神经系统中信息传递的重要单位[15]。VGSC是双功能蛋白,不仅可以通过离子通量和动作电位的变化调节细胞内信号通路、影响突触连通性、递质释放、可塑性和其他细胞过程[16],还能促进转录调节、蛋白质支架、细胞粘附和细胞内信号传导[17]。TTX可以在细胞膜外侧与VGSC位点1选择性结合[18],毒素分子1∶1阻塞钠离子通道外口形成空间位阻,阻止钠离子通过细胞膜,阻断大多数神经元和肌肉细胞产生动作电位,阻碍神经元通信。TTX仅对钠离子通道产生影响,是TTX产生毒性的关键作用靶点。
小胶质细胞是一类维持神经系统稳态的免疫细胞[19],是中枢神经系统中极为重要的免疫防线[20,21]。小胶质细胞膜上存在多种离子通道表达[22],其中包括可以与TTX特异性结合的VGSC。VGSC能够控制小胶质细胞的吞噬作用、板状伪足的延伸和迁移以及细胞因子的释放,参与细胞多项生理过程,调节神经炎症反应,抵抗外界损伤[23]。因此,本研究选择评价中枢神经系统中免疫调节作用的BV-2小胶质细胞作为细胞模型,验证TTX的作用机制,探索毒素暴露对细胞产生的潜在损伤。
目前,关于TTX的体外研究大多集中在急性中毒以及亚致死剂量的评估[24,25],对神经细胞生命活动的毒性效应尚不清楚,忽视了细胞自身损伤可能导致的炎性反应及潜在的不良风险。本研究选择BV-2细胞作为TTX暴露的细胞模型,借助VGSC激动剂藜芦定(veratridine, VTD)和钠钾泵抑制剂毒毛旋花苷G(ouabain, O)验证细胞膜上离子通道表达情况,通过检测细胞增殖活性、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放量、钙离子浓度,活性氧(reactive oxygen species, ROS)浓度和细胞凋亡率评估细胞氧化应激损伤水平,探讨细胞损伤的毒性效应。相较于传统的毒理学研究[26,27,28],本研究丰富了TTX体外暴露后神经细胞损伤数据,以期为进一步评估TTX的食品安全和公共卫生健康风险提供依据。
1、材料与方法
1.1材料与试剂
TTX标准物质(纯度≥99%,北京坛墨质检科技股份有限公司),VTD标准物质(纯度≥98%,上海麦克林生化科技有限公司),毒毛旋花苷G标准物质(纯度≥96%,上海麦克林生化科技有限公司),DMEM-F12培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Invigentech公司),青霉素-链霉素溶液(美国HyClone公司),0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司),细胞毒性检测试剂盒(美国Invigentech公司),LDH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),Fluo-4AM钙离子检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
1.2仪器与设备
CTR4000荧光倒置显微镜(德国Leica公司),Spectra MAX M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司),DM6 CS激光共聚焦显微镜(德国Leica公司),FACS Canto流式细胞仪(美国BD公司)。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养
小鼠小胶质细胞BV-2为实验室自存细胞。将冻存BV-2细胞从液氮罐取出,使用配置培养基(89% DMEM-F12+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素)复苏并接种于培养瓶中,在37°C、5%CO2条件下稳定培养,根据细胞生长情况次日或隔日更换培养基,每周传代两次。
1.3.2细胞形态变化
制备细胞悬液接种于96孔板,每孔1×104个细胞,在恒温培养箱中过夜,使细胞贴壁。提前使用配制培养基将TTX稀释至终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol·L-1的工作溶液,取出孔板观察细胞生长密度,达到对数生长期后去除原有培养基,进行TTX单独暴露,不同浓度TTX重复暴露3次,总暴露时长24 h,观察并记录细胞形态变化。
1.3.3细胞活力检测
细胞接种及暴露条件同1.3.2,每孔加入10μL CCK-8溶液,避光孵育2 h,使用多功能酶标仪,检测各孔450 nm的吸光度值(OD),计算细胞活力。细胞活力(%) =(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。
1.3.4钠离子通道特异性阻塞检测
细胞接种同1.3.2,根据报道[29]使用DMSO溶解配置VTD和O工作溶液,并按照1∶20比例设置细胞肿胀暴露剂量,为了探究TTX对细胞肿胀的剂量依赖性抑制作用,在细胞中加入终浓度为25μmol·L-1的VTD工作溶液和终浓度为500μmol·L-1的O工作溶液,以及终浓度为0、0.1、1、10、100μmol·L-1的TTX工作溶液,使用显微镜观察,并记录细胞形态变化。按照1.3.3方法测试细胞活力变化,评估TTX对细胞膜上钠离子通道的特异性阻塞能力。
1.3.5 LDH检测
细胞接种及暴露条件同1.3.2。收集原有培养基和细胞至离心管,根据LDH检测试剂盒进行细胞匀浆蛋白含量和LDH释放测定。使用多功能酶标仪记录吸光度数据,采用450 nm滤光片以及650 nm作为参考波长检测各孔的OD值。LDH活性(U/gprot)=(OD测定-OD对照)/(OD标准-OD空白)×标准液浓度/样本蛋白浓度。
1.3.6钙离子检测
将细胞以每孔2×105个接种于24孔板中进行稳定培养,次日弃去原有培养基,更换为终浓度0.01、0.1、1、10、100μmol·L-1的TTX工作溶液,对照组为DMEM-F12配制培养基,干预24 h。将Fluo-4AM探针母液室温放置5 min复温,使用PBS稀释为终浓度1μmol·L-1的Fluo-4AM工作液。取出孔板,去除原有培养基,PBS轻轻清洗3遍,加入配置好的Fluo-4AM工作液,避光孵育45 min,取出孔板用PBS轻轻清洗3次,去除未进入细胞内的荧光探针以降低细胞的背景荧光,再次避光孵育15 min,使用激光共聚焦显微镜拍照记录细胞内钙离子相对荧光强度。相对荧光强度=荧光强度/荧光面积。
1.3.7 ROS含量检测
细胞接种及暴露条件同1.3.2。注意后续步骤均应避光操作,去除原有培养基,将各孔更换为100μL终浓度为10μmol·L-1 DCFH-DA试剂的无血清培养基,孵育20 min,使用无血清培养基轻轻清洗细胞两次,去除未进入细胞内的荧光探针,降低细胞的背景荧光。通过荧光倒置显微镜观察并记录细胞形态变化,设定多功能酶标仪激发波长488 nm,发射波长525 nm,测定各孔的荧光强度数值。
1.3.8流式细胞术检测
使用无血清培养基润洗6孔板,加入配置好的细胞悬液使每孔5×105个细胞进行稳定培养,次日观察细胞状态及密度,当细胞密度达到80%时,5孔分别更换培养基为终浓度0.01、0.1、1、10、100μmol·L-1的TTX工作溶液,对照组为DMEM-F12配制培养基,干预24 h。每个样本离心收集1×105个细胞,使用Annexin V-FITC结合液和碘化丙啶染色液对细胞进行双重染色,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
1.4统计学方法
所有实验至少重复3次,数据使用Microsoft Excel记录整理。采用GraphPad Prism 8进行统计分析。定量资料以
表示,组间差异分析采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 TTX暴露对BV-2细胞形态的影响
TTX暴露24 h后,BV-2细胞形态变化如图1所示。与对照组比较,100μmol·L-1 TTX暴露后的细胞呈现圆形状态,边缘清晰可见,部分细胞呈现聚集现象,贴壁细胞增多,少量细胞表现为肥大、多边形激活形态。
图1 BV-2细胞形态图(50μm)
2.2 TTX暴露对BV-2细胞活力的影响
细胞活力的改变可以较为直观地反映细胞生长状态。BV-2细胞在不同浓度TTX暴露条件下干预24 h后,CCK-8检测结果如图2所示。与对照组比较,随着TTX浓度的升高,细胞生长活力逐渐下降,100μmol·L-1 TTX可以明显抑制BV-2细胞增殖,P<0.05。
图2暴露24 h后不同浓度TTX对BV-2细胞活力的影响
2.3钠离子通道特异性阻塞检测
VTD和O作为钠离子通道调节剂可以最大限度地锁定钠离子通道的开放构象,并抑制钠钾泵转运细胞内外离子,引发细胞膜内外钠离子浓度差,导致膜内外渗透压改变,细胞肿胀损伤。TTX可以阻塞钠离子通道,对VTD和O产生拮抗作用。如图3所示,与对照组比较,25μmol·L-1 VTD暴露组细胞活力降低至88.38%,500μmol·L-1O暴露组细胞活力降低至73.94%,VTD+O暴露组细胞活力降低至42.61%,P<0.05。TTX可以中和VTD+O的毒性,中和能力与TTX浓度呈剂量依赖性,浓度越高,中和能力越强。100μmol·L-1 TTX可以对VTD+O毒性产生显著拮抗作用,细胞活力提升至60.63%。这表明,TTX通过阻塞BV-2细胞膜表面的VGSC来抑制钠离子内流。
图3 TTX特异性阻塞BV-2细胞钠离子通道的检测结果
2.4 TTX暴露对BV-2细胞LDH的影响
LDH可以反映细胞膜受损状况,释放量与细胞受损程度有着密切的关系。如图4所示,与对照组比较,TTX暴露后细胞释放大量LDH,随着TTX浓度升高,释放量逐渐增多。在10μmol·L-1 TTX暴露条件下,LDH的相对释放量为3.61 U/g, 100μmol·L-1可达到4.01 U/g,与对照组比较,P<0.05。这提示,TTX可以促使BV-2细胞膜受损,造成细胞内LDH外漏。
2.5 TTX暴露对BV-2细胞钙离子的影响
Fluo-4AM是一种常用于检测细胞内钙离子水平的荧光探针,可以穿透细胞膜与钙离子结合产生荧光。如图5所示,TTX干预BV-2细胞24 h后,使用Fluo-4AM进行染色,通过激光共聚焦图像观察,与对照组比较,在100μmol·L-1 TTX暴露条件下,细胞内的相对荧光强度可达到84.78%,P<0.05。这提示,TTX可以破坏BV-2细胞内部的钙离子自我调节能力,导致细胞自身稳态失衡,造成细胞损伤。
2.6 TTX暴露对BV-2细胞活性氧的影响
ROS是细胞代谢过程中的副产物,过量增加将造成细胞氧化损伤。如图6所示,TTX暴露24 h后伴随暴露浓度的升高,细胞内相对荧光强度增强。这说明,ROS产量增多,细胞受影响程度增大。与对照组比较,在10和100μmol·L-1 TTX刺激下,细胞内ROS的相对荧光强度可达到57.46%和63.48%,P<0.05。这表明,TTX可以通过蓄积ROS,促进氧化还原反应,造成BV-2细胞氧化应激。
图4 TTX暴露对BV-2细胞LDH的影响
图5 TTX暴露对BV-2细胞钙离子的影响
图6 TTX暴露对BV-2细胞活性氧的影响
2.7 TTX暴露对BV-2细胞凋亡的影响
通过流式细胞分析图可以了解细胞的损伤比例,X轴为Annexin V-FITC染色,Y轴为碘化丙啶染色,不同象限分别代表不同损伤、凋亡状态。如图7所示,与对照组比较,BV-2细胞经过TTX暴露24 h后,较低剂量即可引发细胞凋亡,在0.01μmol·L-1时,BV-2细胞凋亡率可达到3.8%,100μmol·L-1 TTX时,细胞凋亡率将增加2.9倍,凋亡水平与暴露浓度依赖性增高,P<0.05。
3、讨论
TTX作为一种天然神经毒素存在于部分海洋和陆生生物体内。众多学者基于模型动物以及细胞实验对TTX进行了探索。Abal等[30]给予实验动物口服TTX 2 h后发现,动物的肝脏、脾脏和肠道有超微结构的变化,包括细胞空泡化、线粒体肿胀和细胞膜破坏等。Zhong等[31]发现,TTX对小鼠肝脏和肾脏存在剂量依赖性毒性作用,组织病理学结果显示,随着TTX剂量的增加,肝脏和肾脏的炎性细胞浸润变得严重。这表明,口服TTX可在短时间内导致器官及细胞损伤。在大鼠模型和蝾螈的脑组织中可检测到TTX,含量远高于血液水平。这表明,TTX可能具有穿越血脑屏障侵犯中枢神经系统的能力[32],并对机体产生影响。因此,需要做更多的研究工作来了解TTX可能造成的损害,评估其构成的潜在健康风险。基于BV-2细胞,本研究通过测定TTX暴露后细胞各项代谢指标活性变化,评估细胞氧化应激损伤程度,探究TTX作用于神经细胞的损伤特征。
图7 TTX暴露对BV-2细胞凋亡的影响
本研究发现,伴随暴露浓度增加,BV-2细胞活力整体呈现下降趋势,100μmol·L-1 TTX可以明显抑制BV-2细胞增殖,而低浓度暴露条件下几乎没有影响,这可能与TTX阻塞钠离子通道作用的可逆性以及细胞通过自身调节作用可以恢复内稳态动态平衡有关。这种1∶1阻塞造成的非致死性损伤毒性效应与报道[33]相一致。使用TTX与钠离子通道特异性激活剂VTD和钠钾泵抑制剂O混合物联合暴露,进行钠离子通道特异性渗透肿胀实验。VTD和O共同作用使大量钠离子汇集在BV-2细胞内部,造成细胞膜内外浓度差异,引发细胞肿胀,甚至功能障碍。TTX单独暴露并不会对BV-2细胞造成显著性增殖影响,在联合暴露组实验中,TTX通过阻塞通道外口拮抗VTD和O造成的细胞内外离子差异,延缓细胞损伤状态,与对照组比较具有显著的差异性改变。本研究证实,BV-2细胞膜上存在VGSC,TTX可以与细胞膜表面的钠离子通道受体位点特异性结合,阻止钠离子持续流入细胞内部。在正常生理条件下,LDH存在于细胞内部,当细胞膜严重受损或通透性发生改变时,可经由破损处大量泄露,常被用于评估炎性损伤反应。本研究显示,在10μmol·L-1 TTX刺激条件下,BV-2细胞LDH的相对释放量为3.61 U/g,在100μmol·L-1TTX刺激睛,LDH可达到4.01 U/g。由此可见,TTX暴露浓度与BV-2细胞乳酸脱氢酶释放量呈现剂量-效应关系递增关系。这表明,TTX可以通过影响BV-2细胞膜通透性引发细胞微环境改变,导致细胞受损,LDH漏出。钙离子是细胞内重要的第二信使,参与调节细胞生命活动,其作用基础是细胞内外钙离子的浓度梯度差异,浓度失衡将造成细胞迁移、增殖、轴突发生不可逆损伤,严重影响细胞功能的表达[34]。通常情况下,细胞内钙离子的静息浓度低于细胞外游离的钙离子浓度约两到三个数量级,当细胞受到某种刺激时,细胞内钙离子浓度会大幅度增加,产生信号并传递给下游通路,激发多种信号因子和酶活性。本研究发现,100μmol·L-1 TTX刺激可导致BV-2细胞内的钙离子浓度大幅升高,相对荧光强度达到84.78%。ROS浓度变化反映细胞氧化应激水平,与钙离子浓度相辅相成。抗氧化防御机制可以清除多余的ROS,促进细胞代谢,恢复动态平衡状态,当大量ROS累积超过细胞自身抗氧化机制防御能力的极限时,则会导致蛋白质和脂质完全受损、细胞凋亡炎症过程以及其他病理生理状况[35]。Murata等[36]研究发现,急性神经炎症可导致BV-2细胞的炎症因子增加,造成细胞氧化损伤,加重神经元的退化、变性甚至死亡。本研究显示,TTX暴露后BV-2细胞活性氧含量明显提升,相对荧光含量随着毒素浓度的升高不断增强,在10μmol·L-1和100μmol·L-1 TTX刺激条件下,BV-2细胞内相对荧光含量分别达到57.46%和63.48%,与对照组比较具有较大差异,细胞呈现氧化应激状态。这说明,TTX可能诱导BV-2细胞抗氧化防御改变,产生氧化应激效应,破坏BV-2细胞内部稳态,造成细胞损伤甚至凋亡。细胞凋亡机制可通过细胞与免疫系统产生相互作用外在激发,也可由细胞检测到自身损伤时主动触发,激活效应将导致多个重要细胞组分改变,诱导细胞凋亡。细胞凋亡率是评价外界环境的不利影响因素对细胞损伤效应的关键指标。本研究发现,较低剂量TTX暴露即可诱导细胞产生凋亡,当暴露浓度增加时,细胞凋亡率升高,与对照组比较,100μmol·L-1 TTX刺激后BV-2细胞凋亡率提升2.9倍,显著影响了细胞正常代谢能力。
综上所述,在TTX暴露的刺激作用下,TTX会激活BV-2细胞,破坏细胞氧化还原平衡,导致氧化应激损伤,造成细胞内稳态改变,诱导细胞凋亡甚至坏死,这为揭示TTX对神经细胞造成的影响提供了新的依据。
文章来源:赵长源,贾雪霞,郭艺芬等.河豚毒素对BV-2细胞氧化应激损伤的诱导作用[J].滨州医学院学报,2024,47(02):106-113.
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