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水蛭素对糖尿病肾病大鼠糖代谢水平影响对肾功能保护作用

2024-09-12 131 上传者：管理员

摘要：目的探讨水蛭素对糖尿病肾病(DN)模型大鼠糖代谢水平的影响及对肾功能的保护作用。方法 SPF级雄性SD大鼠70只，采用数字表法随机分为空白组(10只),造模组(60只)。造模组采用高糖高脂饮食+单次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg,诱导DN模型大鼠。将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、水蛭素低、中、高剂量组、贝那普利组，每组10只，灌胃给药干预10 w。观察各组一般状态，干预结束收集大鼠24 h尿量(UV)、血液、肾脏样本；检测大鼠血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、胱抑素(Cys)-C、尿液β2-微球蛋白(β2-MG)等指标，计算肾脏肥大指数(KI);病理切片观察大鼠肾组织病理改变。结果与空白组相比，模型组体质量明显降低，24 h UV、β2-MG、空腹血糖(FBG)、HbA1c、BUN、Scr、Cys-C水平及KI值显著增高(P<0.01)。与模型组相比，水蛭素中剂量组FBG、HbA1c、BUN、Scr、Cys-C、24 h UV、β2-MG水平、KI值明显降低(P<0.05,P<0.01),体质量无明显差异(P>0.05);水蛭素高剂量组体质量增加，但差异无统计学意义(P>0.05),其他各项指标均显著降低(P<0.01);观察大鼠肾组织病理切片，水蛭素中、高剂量组肾损伤明显减轻。结论水蛭素具有保护DN大鼠肾功能的作用，其作用机制与降低DN大鼠血糖、HbA1c水平，延缓炎性因子对肾脏的损伤有关。

关键词：
水蛭素
糖代谢
糖尿病肾病
肾功能
肾小球肾炎
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糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最重要的合并疾病之一[1],中国糖尿病发病率呈上升趋势，其并发症也随之上升，30%左右的糖尿病患者会罹患DN,目前DN已成为终末期肾脏病(ESRD)的第二位原因，仅次于肾小球肾炎。一旦发展为ESRD,会给患者生命健康造成很大威胁，同时增加医疗负担，早期防治肾脏病变对DN患者十分重要。

目前DN的治疗主要是控制血糖和血压、降低血脂、优质蛋白饮食及应用血管紧张素Ⅰ转化酶抑制药、肾脏透析等，虽然西医治疗有一定效果，但很多患者依旧发展成ESRD[2],而且肾脏透析高额的费用和药物引起的严重不良反应也不容忽视。中药治疗疾病遵循均衡和多靶点调节作用的原则，且副作用少，尤其在延缓慢病发生、发展进程方面发挥极大作用。因此，探索中医药防治DN对于DN患者和社会而言，具有节约医疗经费和减轻药物不良反应的重要意义，也可降低对社会医疗体系的压力。

DN在中医上常被认为“消渴”“水肿”“下消”范畴，从中医药中探索其防治具有重要意义[3]。仝小林教授认为“肾络瘀滞”是该病重要病理基础之一，血瘀于肾，在DN治疗中活血化瘀、改善微循环必不可少，仝教授在临床中为“祛瘀”“通络”常用水蛭[4]。水蛭，又称为蚂蟥，中医学认为它具有破血、逐瘀、通经的功效，目前多用于抗凝、抗血栓等治疗，在中医治疗DN中已有应用，并取得了一定的疗效；水蛭素是水蛭及其唾液腺中活性最显著的一种蛋白质[5]。文献报道，水蛭素具有较强的抑制凝血和抗血栓形成作用，具有抗炎、改善糖尿病并发症等作用[6],但尚未报道水蛭素对DN大鼠糖代谢及改善肾功能的作用，更无将其用于DN防治的相关研究。本研究观察水蛭素对模型大鼠糖代谢(血糖、糖化血红蛋白)水平影响及对肾功能的保护作用，为水蛭素在临床防治DN提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

70只SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量250～300 g,由河南省实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(豫)2017-0001,动物合格证号：410975201100029341。存放于黄河科技学院医学实验动物房，室温18～24℃,湿度50%～70%条件下适应1 w,自由饮水、摄食。饲料：普通饲料(北京环宇中科生物科技有限公司),高糖高脂饲料(普通维持料67.5%+蔗糖20%+猪油10%+胆固醇2%+胆酸钠0.5%),购于南京盛民科研动物养殖场(生产批号：20201019)。

1.2试剂及药品

链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),枸橼酸钠缓冲液(福州飞净生物，生产批号：20201020),盐酸贝那普利(北京诺华制药有限公司，生产批号：X3050),水蛭素(陕西格润生物科技有限公司，生产批号：20201016),大鼠β2微球蛋白(β2-MG)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(生产批号：20201217)、苏木素、伊红染色剂(生产批号：20201221)均购于南京建成生物技术有限公司，无水乙醇(生产批号：20201207)、过氧化氢(生产批号：20201207)、石蜡(生产批号：20200709)均购于北京化工有限公司，磷酸盐缓冲液(南京生航生物技术有限公司，生产批号：BC20201228),二甲苯(无锡浩淼华工科技有限公司，生产批号：20200413)。

1.3实验仪器及设备

全自动生化分析仪(B200V,南京英诺华公司),血糖仪(EA-12,三诺生物传感股份有限公司),石蜡切片机(HS-102,邢台慧思科技有限公司),全封闭自动组织脱水机(FAJ-301A,上海珂淮有限公司),通用台式冷冻离心机(3K15d,德国SIGMA公司)。

1.4建立模型

依据大鼠DN造模文献[7,8],选用70只雄性SD大鼠，SPF级，体质量180～200 g。适应性喂养1 w后，采用数字表分组法将70只雄性SD大鼠分为空白组(10只),普通饲料规律喂养，自由饮水；另外60只为造模组，采用高糖高脂饲料喂7 w后，大鼠禁食不禁水12 h,造模组单次腹腔注射STZ溶液，60 mg/kg,空白组注射等体积0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.3)。3 d后，尾静脉取血，血糖仪检测血糖水平，连续3 d 3次均>16.7 mmol/L,且1 w后检测尿蛋白阳性即DN造模成功。其中4只血糖、尿蛋白未达标，均弃用，2只死亡，考虑胰岛细胞损伤过多，即建立模型成功54只，随机选取50只纳入实验。每天观察大鼠一般情况(活动度、对刺激反应、摄食量、二便、体质量、皮毛等)。

1.5分组及给药

选取造模成功的50只大鼠，随机分为模型组、水蛭素低、中、高剂量组、贝那普利组，每组10只，继续高糖高脂喂养。贝那普利组每日采用盐酸贝那普利片10 mg/kg灌胃1次，水蛭素低、中、高剂量组分别给予水蛭素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，1次/d;模型组及空白组采用等量生理盐水灌胃，干预10 w。

1.6尿液指标检测

药物干预10 w后，将实验大鼠置代谢笼内，自由饮水，禁食。应用代谢笼法收集并测量大鼠24 h尿量(UV);取少量尿液于4℃、3 000 r/min,离心10 min,取上清液，严格参照ELISA试剂盒说明，检测大鼠尿液中β2-MG水平。

1.7糖代谢检测

所有大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，固定，腹主动脉取血，全自动生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

1.8肾功能指标检测

采用全自动生化分析仪检测血清中血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素(Cys)-C水平。

1.9体质量及肾脏肥大指数(KI)检测

处死大鼠，取肾脏样本(两侧)并称重，统计大鼠体质量，以单肾重(mg)/大鼠体质量(g)值表示KI。

1.10病理组织染色

取大鼠左侧肾脏，石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇至ddH2O,苏木素染色4 min,自来水冲洗，1%盐酸乙醇分色2 s,自来水洗后酸化伊红复染2 min,水洗，脱水，透明，封片，显微镜下观察左侧肾脏形态及结构的变化。

1.11统计学方法

采用SPSS25.0软件进行正态性检验，多组间比较应用单因素方差分析，组间比较用最小显著性差异法。

2、结果

2.1一般情况

空白组活动迅捷，毛色光滑，摄食饮水及二便可正常；与空白组比较，模型组活动迟缓，毛发泛黄无光泽，摄食、饮水、UV 7 w前明显增多，以后减少，且体质量降低；与模型组相比，水蛭素低剂量组各项情况并无明显改善，贝那普利组、水蛭素中、高剂量组活动度、精神状态、皮毛均有好转，摄食、饮水、UV均有所减少。实验过程中，模型组、水蛭素中剂量组各死亡2只，水蛭素低剂量组死亡3只，均考虑酮症酸中毒，贝那普利组和水蛭素高剂量组因灌胃操作不当各死亡1只。

2.2各组肾脏组织病理学观察

如图1所示，空白组：肾小球结构正常，囊腔未见粘连、狭窄等病理改变，肾脏皮质、髓质未见异常改变，肾小管结构正常，未见细胞坏死、增生等变化；模型组：肾小球可见充血、硬化、囊腔扩大，有玻璃样物质沉积，肾间质有纤维化改变，可见炎细胞浸润，大多肾小管上皮细胞有水肿、颗粒样变，部分管腔扩大明显；贝那普利组：与模型组相比肾小球结构基本正常，未见玻璃样物质沉积，肾间质纤维化较轻，肾小管结构无明显病变；水蛭素低剂量组：较多肾小球呈充血改变，肾间质呈纤维化改变，有炎细胞浸润，部分肾小管管腔扩大明显。水蛭素中剂量组：肾小球呈轻度充血改变，部分肾间质可见少量纤维化改变，由少量炎细胞浸润，部分肾小管上皮存在肿胀，管腔扩大不明显。水蛭素高剂量组：肾小球、肾间质结构基本正常，肾小管可见少量管腔扩张。

图1各组肾脏病理(HE染色，×200)

2.3各组尿液指标比较

如表1所示，与空白组比较，各组24 h UV、β2-MG水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，药物干预组β2-MG水平及24 h UV明显降低(P<0.05,P<0.01)。

2.4各组糖代谢指标比较

如表1所示，与空白组相比，模型组FBG、HbA1c水平显著升高(P<0.01),水蛭素低、中剂量组HbA1c水平显著升高(P<0.05);与模型组相比，除水蛭素低剂量组FBG水平无统计学差异(P>0.05),其他药物干预组FBG、HbA1c水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。

2.5各组肾功能指标比较

如表2所示，与空白组相比，各组血清BUN、Scr、Cys-C指标均明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组相比，贝那普利组上述指标均显著降低(P<0.01),水蛭素低剂量组BUN和Scr均明显降低(P<0.05),水蛭素中、高剂量组BUN、Scr、Cys-C均显著降低(P<0.01)。

与空白组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.05,4)P<0.01;下表同

表1各组24 h UV、β2-MG、FBG、HbA1c水平比较

2.6各组体质量及KI比较

如表2所示，与空白组相比，各组体质量明显降低，KI明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较，贝那普利组体质量显著增加(P<0.01),贝那普利组、水蛭素中、高剂量组KI明显降低(P<0.05,P<0.01)。

表2各组血清BUN、Scr、Cys-C、体质量及KI比较

3、讨论

DN是糖尿病一种重要的细小血管并发症，主要表现为肾小球病变，随着病程的进展，出现持续蛋白尿，进而肾功能不全、尿毒症。现常用依那普利、氯沙坦等药物治疗，但这些药物对于血压正常的患者无效，甚至可能引起一系列不良反应[9]。水蛭是我国一味传统中药，传统医学认为其具有破血、逐瘀、通经等功效，其疗效是经过长期检验的，随着中医学的发展，对水蛭的研究也逐渐深入，许多水蛭制剂运用于多种疾病，比如在心脑血管系统、泌尿系统的运用中，取得了良好的治疗效果[10],也有将水蛭用于DN的相关研究。现代药理学对水蛭素的研究发现其具有抗凝、抗血栓形成的作用，可明显改善DN患者微循环障碍，研究还表明其在保护DN患者肾功能、降低尿蛋白等方面具有较好效果，此外还具有抗氧化、降低炎性因子生成和抗增殖等作用[5,11]。

持续高血糖状态能加速HbA1c的合成过程，使血中HbA1c水平明显增加，HbA1c增高，使红细胞僵硬，不易透过毛细血管，红细胞膜的流动性减少，引起组织缺氧，直接影响毛细血管的血液循环及组织细胞氧的供给，从而造成组织损伤，导致DN病情进展。高血糖使肾小管上皮细胞产生多种细胞炎性因子，还会引起肾脏组织中血流动力学改变，进而引起氧化应激反应、炎症反应、肾脏组织结构改变等一系列异常，这是肾脏病变的基础[12,13],高血糖还可以刺激肾小管上皮细胞转化为间充质细胞，细胞外基质合成异常，肾脏组织损害会进一步加重[14],所以控制血糖水平对于延缓DN进展十分重要。本研究结果说明，水蛭素干预在血糖调节中有一定作用；HbA1c水平高低反映近23个月糖代谢情况，并且不易受其他因素影响，可以反映胰岛β细胞功能，此外还可以间接反映肾脏功能损伤程度[15]。本研究证实，中、高剂量水蛭素干预的DN大鼠精神状态、活动、皮毛等一般情况有明显改善。有研究显示，水蛭素可降低大鼠尿液中尿酸浓度[16],β2-MG是衡量糖尿病患者肾功能减退和疗效观察的一项重要指标。本研究揭示，水蛭素可能通过降低蛋白排泄量发挥保护肾功能的作用，而且高剂量水蛭素作用最明显，且水蛭素明显改善了DN大鼠消瘦状况。

DN发生时，肾脏组织中肾小球毛细血管内皮细胞受到损伤，使得尿液中存在蛋白，肾脏滤过率降低，内皮损伤加重，主要表现有BUN、Scr水平升高，血清BUN、Scr水平高低能够反映DN肾脏损伤的程度[17]。本研究结果表明，水蛭素干预可不同程度降低大鼠BUN、Scr水平，尤其是高剂量更显著，以保护DN大鼠肾脏。Cys-C是广泛存在于体液及细胞内的半胱氨酸蛋白酶抑制物，不受血脂等因素干扰，仅由肾脏负责清除，主要是在肾小球滤过，重吸收后会被完全分解，反映肾小球滤过率，可作为评价肾脏功能的指标[17,18],本研究结果提示，水蛭素可以增强DN大鼠肾脏滤过功能。

参考文献:

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基金资助:2020年国家级大学生创新创业训练计划项目(202011834016);

文章来源:郭晓娜,张楠,牛美兰.水蛭素对糖尿病肾病大鼠糖代谢水平的影响及对肾功能的保护作用[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4297-4301.