生长激素(growth hormone, GH) 是一种由垂体前叶的生长激素细胞合成的多肽类激素，已知GH对维持代谢、生长发育具有重要作用，如胰岛素调节和脂肪酸代谢[1～3]。此外，GH在早期器官生长发育中起主要作用。GH通过与脑、肌、骨骼和肝细胞上的生长激素受体(growth hormone receptor, GHR)结合驱动生长[4～6]。GHR信号途径激活及其下游信号通路激活，可以促进肝脏等胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors 1,IGF-1)的合成和分泌，IGF-1具有调节代谢、神经发育等作用[7～9]。大脑也是生长激素作用的重要靶器官，大脑发育与生长激素作用紧密相关。有研究表明，幼年时期生长激素缺乏导致大脑发育受损，出现认知和记忆功能减退等神经功能异常[10,11]。

解析GHR阳性神经细胞的分布，是理解生长激素调节大脑发育的重要环节。GH结合并激活GHR后，STAT5会被磷酸化，随后进入细胞核调控基因的转录。有研究利用免疫组织化学检测GH处理后的神经元中磷酸化STAT5(phospho-STAT5, pSTAT5),发现GHR反应神经元中主要存在于中枢神经系统(central nervous system, CNS)的下丘脑多个区域[12,13],比如，视上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)、弓状核(arcuate nucleus, ARC)以及室旁核(paraventricular nucleus, PVN)等。但由于检测是通过pSTAT5间接检测GHR反应细胞，实验中pSTAT5分布与GHR mRNA原位杂交结果不能完全重合。常规抗体染色的效果欠佳，不能清晰反映GHR阳性细胞的分布。因此，需要更加特异和清晰的标记方法，观察全脑GHR阳性神经细胞的分布情况。由于GHR分布广泛，GHR及其下游级联信号对生长发育都具有重要的调控作用。采用神经元特异性敲除GHR的方法，能够更加特异地观察GHR信号对新生小鼠神经元发育的影响。

本研究通过构建可诱导型GHR报告基因小鼠和神经元特异性GHR敲除小鼠，主要观察GHR阳性神经元在大脑中的分布情况以及对大脑发育的作用。研究发现，GHR阳性细胞在大脑散在分布，GHR阳性神经元主要集中在下丘脑的PVN。特异性敲除神经元上的GHR后，下丘脑区域的神经元、胼胝体中的髓鞘以及皮层中胶质细胞未发生明显形态或密度的改变。提示GHR阳性神经元可能不参与GH调控大脑发育的过程，至少不是重要的一环。

一、材料和方法

1. 实验动物

使用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到GHR-CreERT品系和GHR floxed品系小鼠 [江苏集萃药康生物科技股份有限公司， 动物生产许可证号： SCXK(苏)2023-0009]。GHR-CreERT系是通过在外显子2a和2b之间插入CreERT-IRES(2.6kb)序列而产生的，而GHR floxed品系小鼠系是通过外显子4～11两侧插入loxP位点而产生的。使用mT/mG(The Jackson Laboratory, 编号#007676)小鼠品系和GHR-CreERT品系小鼠杂交得到GHR报告基因小鼠GHR-CreERT; mT/mG mice。GHR floxed品系与Thy1-CerERT; YFP(The Jackson Laboratory, 编号#012708)品系杂交得到条件性基因敲除的Thy1-CerERT;YFP;GHR floxed品系小鼠。所有转基因小鼠均在出生后(postnatal, P)第3天(P3)诱导和P10取材，用于观察发育大脑。所有动物实验均经陆军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。

2. 他莫昔芬诱导

他莫昔芬(Sigma-Aldrich, Cat: T5648) 配制成浓度为30 g/L的玉米油溶液用于诱导重组。他莫昔芬小鼠灌胃(50 mg/kg),每日1次，持续4 d。

3. 实验动物取材

20%乌拉坦溶液腹腔注射(1.5 g/kg)麻醉小鼠，将已麻醉的动物固定于泡沫板上，经腹打开胸腔，灌注针从心尖插入左心室，剪开右心耳，先快速灌注PBS, 5 min后灌注4%多聚甲醛溶液(paraformaldehyde, PFA)至躯体僵硬。完成灌注后，剥开颅骨，取出脑组织放置于PFA中后固定10 h, 30%蔗糖溶液脱水处理3 d。使用冷冻切片机(Cryostar NX50 OP,Thermo Fisher Scientific)切片，厚20 μm。切片储存于冷冻保护液(30% 乙二醇，30%蔗糖，1 mol/L PBS),4 ℃避光冷藏。

4. 免疫荧光染色

5% BSA和0.5%Triton-X100混合溶液在室温下封闭脑切片2 h, 一抗中4 ℃孵育过夜，随后室温条件下荧光二抗孵育2 h(抗体信息见表1)。使用共焦激光扫描显微镜(Olympus, SpinSR 10, Shinjuku, Tokyo)或荧光显微镜(Olympus, VS200,Shinjuku, Tokyo)获取荧光图像。

5. 统计学处理

使用GraphPad Prism 6.01软件对数据进行统计学处理。所有数据均以平均值±标准误

表示。n代表每次实验使用的小鼠数量。用非配对t检验确定两个实验组之间的统计学意义。当原始数据呈非正态分布时，采用非参数Mann-Whitney检验。无统计学意义的报告为P>0.05; 有统计学意义的报告应为P<0.05。

二、结果

1. GHR报告基因小鼠的构建

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术[14],在GHR启动子后插入CreERT-IRES序列(2.6kb)获得GHR-CreERT转基因小鼠，与mT(OMATO)/mG(FP)报告基因小鼠杂交得到GHR-CreERT; mT/mG品系小鼠。使用他莫昔芬进行诱导，Cre重组酶剪切loxp位点，基因mTOMATO和STOP序列被删除，同时启动膜结合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达，实现标记和追踪GHR阳性细胞 (图1)[15,16]。GHR-CreERT; mT/mG小鼠出生后P3给予他莫昔芬(30 mg/kg, 持续4 d)诱导，取P10小鼠的肝脏和大脑。荧光显微镜下可见肝脏和垂体高表达mGFP (图2A,2B),这与之前报道过GHR在肝脏和垂体中表达的研究相符[17],验证了GHR-CreERT; mT/mG品系小鼠报告基因的可靠性。

表1 抗体信息

2. GHR阳性神经元的分布

为探究GHR神经元分布，我们使用神经元特异性标志物神经元核抗原(neuronal nuclei, NeuN)对P10小鼠进行免疫荧光染色。发现GHR阳性细胞分布在皮层(图3A)、海马(图3B)、纹状体(图3C)和下丘脑(图3D)等几乎所有大脑区域，除了下丘脑的GHR阳性细胞与NeuN共标外，其他部位的均不与NeuN共标。并且这群GHR/NeuN双阳性细胞呈现区域性聚集，主要集中在PVN(图3D),提示这群细胞为GHR阳性内分泌神经元。观察不同发育阶段小鼠GHR分布，同样P3诱导，但在P17取材的小鼠，同样可以在皮层(图4A)、海马(图4B)、纹状体(图4C)和下丘脑(图4D)观察到GHR细胞的分布，对比P10小鼠GHR细胞，P17小鼠的GHR细胞密度更低，但在下丘脑PVN区域仍有GHR阳性细胞聚集(图4D)。值得注意的是，无论在哪个发育阶段，GHR阳性细胞都呈现出3种形态：a类在皮层、海马和纹状体可见，数量最多，类血管壁细胞(图5A);b类散在分布于大脑各区域，数量最少，为团状类似星形胶质细胞(图5B);c类主要聚集在下丘脑PVN,区域密度大，并且c类细胞有多个有分支的突起，具有神经元的典型特征(图5C)。有研究表明，GHR阳性神经元主要分布在下丘脑区域，与观察到的c类GHR阳性细胞聚集特点和形态相似[13]。

图1 GHR报告基因小鼠的构建策略和实验方案

图2 GHR报告基因在肝脏和垂体中高表达 免疫荧光染色 标尺示50μm

图3 GHR阳性细胞与NeuN免疫荧光染色在P10小鼠大脑各区域的共表达情况 标尺示50μm

图4 GHR阳性细胞在P17小鼠大脑各区域的分布情况 免疫荧光染色 标尺示100μm

图5 3种不同形态的GHR阳性细胞 免疫荧光染色 标尺示10μm

图6 下丘脑区域GHR阳性细胞与其他类型细胞的共表达情况 免疫荧光染色 标尺示20 μm

图7 Thy1CreERT;YFP小鼠的验证以及Thy1CreERT;YFP;GHR floxed的构建策略

图8 对照（GHR fl/fl）小鼠与神经元特异性敲除GHR(Thy1;GHR fl/fl）小鼠未出现PVN神经元密度的差异

为进一步明确下丘脑聚集的c类细胞类型，本研究对PVN区域GHR细胞采用免疫荧光染色的方法检测神经元(NeuN+)、少突胶质细胞前体细胞(PDGFRα+)、星形胶质细胞(GFAP+)和小胶质细胞(Iba1+)。结果显示，PVN区域GHR阳性细胞与NeuN共标(图6A),未发现与PDGFRα(图6B)、GFAP(图6C)和Iba1(图6D)存在共标的情况。证明下丘脑PVN区域的GHR阳性细胞为GHR阳性神经元。

3.神经元内特异性敲除GHR对新生小鼠大脑神经元和神经胶质等细胞数量的影响

为了理解神经元表达的GHR信号对新生小鼠大脑神经细胞的影响，我们采用选择性在神经元内特异性敲除GHR的方法。Thy1是锥体神经元的特异性启动子，PVN富含锥体神经元[18]。我们使用Thy1CreERT; YFP品系小鼠，这种品系小鼠是通过拷贝两个Thy1启动子，在左右分别插入CreERT序列和YFP报告基因使得两边同时表达[19]。为验证Thy1阳性神经元，在Thy1CreERT; YFP小鼠P10取材，观察到报告基因发现YFP阳性的神经元分布与GHR阳性神经元一样，在PVN区域聚集(图7A),约占PVN区域细胞数量的1/3。将Thy1CreERT; YFP与GHR floxed的小鼠杂交得到Thy1CreERT; YFP; GHR floxed品系，该品系小鼠在诱导重组后，Cre重组酶剪切loxp位点，可以选择性敲除Thy1阳性神经元的GHR基因(图7B)。幼鼠的发育阶段在出生后早期较为迅速，神经系统和相关髓鞘在出生18 d内发育最为显著[20]。实验选取P3小鼠进行他莫昔芬诱导，其中4只Thy1CreERT;YFP; GHR fl/fl敲除 (Thy1; GHR fl/fl) 小鼠以及4只GHR fl/fl对照鼠，在P10取材进行观察。我们首先通过NeuN染色检测了PVN的神经元变化(图8A),与GHR fl/fl对照比较，Thy1; GHR fl/fl小鼠下丘脑NeuN阳性神经元数量未发现明显密度差异(图8B)。

为理解敲除神经元的GHR信号途径对其他脑区细胞的作用，我们使用免疫荧光染色显示髓鞘(MBP+)(图9A)、成熟少突胶质细胞(CC1+)(图9B)、神经元(NeuN+)(图9C)、星形胶质细胞(GFAP+)(图9D)、小胶质细胞(Iba1+)(图9E)以及少突胶质细胞前体细胞(PDGFRα+)(图9F)。通过共焦显微镜成像，观察和统计细胞形态和密度变化。胶质细胞在激活或者应激情况下，细胞形态发生显著变化。但从星形胶质细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞前体细胞形态观察，未见显著变化(图9D～9F)。数量统计结果显示，GHR在Thy1神经元中特异性敲除后，髓鞘面积占比和少突胶质细胞单位面积数量未发生明显变化(图10A,10B),大脑皮层中神经元单位面积数量并未发生显著改变(图10C),以及皮层其他胶质细胞比如星形胶质细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞前体细胞均未发生密度上的变化(图10D～10F)。以上结果显示，特异性敲除神经元的GHR未显著改变发育大脑皮层和胼胝体中的神经元和神经胶质等细胞密度和形态。提示神经元的GHR信号途径，并不显著影响大脑神经元和神经胶质等细胞的发育。

图9 MBP、CC1、NeuN、GFAP、Iba1以及PDGFRα在GHR fl/fl与Thy1; GHR fl/fl小鼠大脑中的表达情况

图10 特异性敲除神经元的GHR未显著改变发育大脑的神经元和神经胶质等细胞密度 n=4

三、讨论

1. GHR在大脑中的分布

GH是调节生长发育的一种重要激素，通过与GHR结合发挥作用，但GHR在新生小鼠脑内的表达情况仍不清楚。受限于GHR抗体的有效性和特异性，免疫荧光染色难以准确定性和定量；采用标记GHR下游靶点pSTAT5的方法，结合原位杂交技术间接定位GH反应阳性细胞准确性也有限[13]。我们构建了GHR-CreERT; mT/mG的报告基因小鼠，为可诱导型的报告基因小鼠。我们发现GHR阳性细胞在垂体和肝脏等区域表达丰富，证明报告基因特异高效。GHR阳性神经元主要聚集在PVN,经过免疫荧光染色定性，我们验证这群GHR细胞为GHR阳性神经元，在下丘脑多处分布。该结果与通过pSTAT5检测GHR阳性细胞分布基本一致。但是pSTAT5反应细胞的分布更加广泛，提示GHR激活可能间接影响pSTAT5细胞的数量。推测与GH产生反应的细胞可能比GHR阳性细胞更多有关。例如：催产素受体(oxytocin receptor, OTR)细胞，也能被GH激活进而产生pSTAT5[21]。而且通过pSTAT5检测GH与GHR的反应是一种间接的手段，不能排除GHR阳性细胞介导其他细胞产生pSTAT5的可能。有趣的是，我们在皮层、海马和纹状体等脑区均未检测到GHR阳性神经元，提示GHR阳性神经元主要是内分泌神经元。在这些区域，检测到大量血管壁样细胞和少量星形胶质样细胞(<1%),提示GHR阳性细胞可能与血管发育和功能有关，值得进一步研究和探索。在此，我们主要研究了下丘脑PVN的GHR阳性神经元，对其分布以及对发育大脑的作用做了初步探究。通过报告基因可视化地分析GHR阳性细胞在脑内的分布情况，帮助我们了解GH在大脑发育中是如何发挥作用的。

2. 神经元的GHR信号对新生小鼠大脑神经元和神经胶质等细胞数量的影响

GH对大脑发育十分重要，在小鼠发育阶段(0～1月，相当于人的0～10岁),GH在血液和脑内浓度一直保持高水平状态，在成年降低后形成脉冲波模式[22]。而GH是通过GHR发挥作用的，GH在出生后的变化也能影响GHR阳性细胞。我们通过对比P10和P17取材的GHR-CreERT; mT/mG品系幼鼠，同样在P3诱导，但发现P17小鼠的GHR阳性细胞分布密度变小，尤其是皮层和海马区域差异较大。推测GHR阳性细胞数量可能与发育需求相关，P17的小鼠白质的髓鞘和灰质的神经元发育完成，可能对于GH/GHR信号需求降低。神经元的发育主要在胚胎中晚期，GHR阳性细胞在胚胎发育各阶段的分布和作用还不清楚。

有研究发现，GH对发育大脑的意义十分重大，当幼年时期出现生长激素缺乏会影响认知功能，经过生长激素替代疗法可抵消这些认知功能的变化[23]。GHR阳性细细胞介导了GH促大脑生长发育的功能，对认知功能有重要影响的大脑区域，例如海马区、杏仁体和海马旁区域，都有GHR细胞存在。大脑发育离不开GH/GHR信号，一旦其缺失，大脑发育期间神经元和胶质细胞的增殖、分化以及成熟都会受到影响。那么神经元中的GHR敲除能够影响发育大脑的各类细胞吗?已确定PVN聚集的GHR细胞为GHR阳性神经元后，我们构建了Thy1CreERT; YFP; GHR floxed品系小鼠用于特异性敲除神经元中GHR。横向对比GHR条件性敲除小鼠与对照小鼠，可以观察GHR敲除对发育大脑的影响，我们首先观察了GHR敲除对PVN区域神经元的影响，结果未发现差异。然后对发育大脑中胼胝体区的髓鞘、皮层神经元以及皮层多种胶质细胞进行一一对比，结果未发现细胞密度和形态上的差异。这些研究提示，敲除神经元的GHR,对新生小鼠大脑的神经元和神经胶质等细胞数量影响有限，但对其长期影响及其调节神经功能的作用尚不清楚。在本实验中使用的Thy1CreERT; YFP; GHR floxed小鼠敲除神经元的GHR,虽然GHR阳性细胞与Thy1阳性细胞共表达于PVN区域，但敲除效率需要进一步确认。本实验评估认知功能还缺乏功能性的判定，比如电生理和行为学数据支持。GHR的敲除也只是在神经元上进行的，这群细胞数量是远低于全脑的GHR阳性细胞，所以形态上没有产生变化也可能只是量的问题。由于下丘脑区域有分泌性神经元，GHR神经元也可能有涉及远距离靶向作用，但在本实验中还没有探究中枢神经系统以外的其他组织器官的变化。这些可能出现的情况，让我们暂时无法揭示这群GHR阳性神经元具体的功能。

参考文献:

[9]曾文钦,杨春,周辛,等.胰岛素样生长因子1在新生大鼠短暂脑缺血损伤修复中的关键作用 [J].解剖学报,2012,43(2):145-149.

基金资助:科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目(2021ZD0201702);

文章来源:夏宇,任淑裕,李涛,等.新生小鼠大脑中生长激素受体阳性神经元的分布和功能[J].解剖学报,2024,55(04):422-429.