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CXC趋化因子配体14对高糖环境中脂肪细胞焦亡的影响

2022-01-06 42 上传者：管理员

摘要：目的探讨CXC趋化因子配体14(CXCL14)对高糖暴露环境中脂肪细胞焦亡的影响。方法利用"鸡尾酒法"诱导3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞,用5.5mmol/L低糖(NG)或25mmol/L高糖(HG)葡萄糖培养基培养脂肪细胞24h;HG环境下用不同浓度CXCL14处理3T3-L1细胞不同时间。Westernblot检测消化道皮肤素(GSDMD)、核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)蛋白、白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达水平。实时荧光定量PCR检测GSDMD、NLRP3、白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA转录水平。LDH测定试剂盒检测脂肪细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力;AnnexinV-FITC荧光检测细胞死亡情况;CCK-8法检测各组细胞增殖活力。结果高糖环境下脂肪细胞焦亡发生率升高,CXCL14处理可提高脂肪细胞增殖活力,但脂肪细胞焦亡相关指标却受到CXCL14浓度梯度的不同影响。50nmol/LCXCL14处理可降低高糖环境下脂肪细胞GSDMD、NLRP3、IL-1βmRNA以及NLRP3蛋白的表达,下调脂肪细胞LDH活力,减少AnnexinV-FITC荧光染色细胞死亡率,但25、100、200nmol/LCXCL14对其焦亡的指标却呈反向趋势。并且50nmol/LCXCL14干预后脂肪细胞NLRP3、Caspase-1蛋白随干预时间的延长呈先下降再上升趋势。结论CXCL14对高糖环境中脂肪细胞焦亡的影响与其浓度存在相关性。

关键词：
CXC趋化因子配体14
环境因素
细胞焦亡
脂肪细胞
高糖
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糖尿病(DM)是一组由遗传和环境因素相互作用所致的一种代谢性疾病，目前已成为世界上最常见且增长最快的疾病之一，预计到2045年将有6.93亿成年人患有糖尿病[1]。2型糖尿病患病率与肥胖密切相关[2]。糖尿病和肥胖的病理机制及其并发症的发生发展都与胰岛素抵抗和炎症过程的激活有关[3,4]。高糖可影响脂肪细胞的分化及肥胖相关性代谢紊乱。暴露于高葡萄糖水平中的脂肪细胞表现出代谢功能受损，成熟脂肪细胞生成过程中长期和短期接触葡萄糖都会促进3T3-L1细胞中甘油三酯的积累[5]。CXC趋化因子配体14(CXCL14)是CXC趋化因子家族的一个成员，可以吸引树突细胞、天然杀伤细胞和单核细胞[6,7]。

近期研究发现，肥胖患者，特别是合并2型糖尿病患者循环中CXCL14水平下降，CXCL14的表达水平与体质指数和葡萄糖/胰岛素稳态受损指数呈负相关，与编码促炎分子的基因表达呈负相关[8]。CXCL14在改善肥胖患者脂肪组织炎症状态和葡萄糖/胰岛素稳态方面具有重要研究意义。焦亡是一种炎症诱导的程序性细胞死亡过程。既往体内外研究均发现，焦亡在糖尿病及其并发症中起重要作用，但具体机制目前暂未阐明[9]。因此，本研究选用3T3-L1细胞为实验细胞模型，探究CXCL14对高糖环境下脂肪细胞焦亡的影响。

1、材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

3T3-L1细胞(ATCC);胎牛血清(加拿大维森特公司);青霉素、链霉素(中国北京博奥森生物技术有限公司);IBMX、地塞米松(美国Sigma公司);胰岛素(苏州美仑生物科技有限公司);CXCL14重组因子(美国Peprotech公司);β-actin抗体(美国Proteintech公司);天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)抗体(美国Proteintech公司);消化道皮肤素(gasderminD,GSDMD)抗体、核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-likereceptorprotein3,NLRP3)抗体、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗体(英国Abcam公司);羊抗兔二抗(上海泊湾生物公司);ECL发光液(美国Gibico公司);乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒(南京建成生物公司);AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物科技公司);油红染色液(北京索莱宝有限公司)。

1.2 细胞培养及分组

3T3-L1细胞采用DMEM、10%胎牛血清、青霉素、链霉素培养，置于37℃、5%恒温孵育箱内，用生长培养基(DMEM+10%FBS)培养细胞至完全融合并充分接触抑制2天，换用诱导液I(DMEM+10%FBS,0.5mmol/LIBMX,1μmol/L地塞米松，10mg/L胰岛素)培养2天，换用诱导液Ⅱ(DMEM+10%FBS,10mg/L胰岛素)继续培养2天，再换用完全培养基(DMEM+10%FBS)继续培养，每隔2天换液。诱导分化第10天，90%以上细胞完全分化为成熟脂肪细胞，用于后续实验。按照暴露环境将细胞分为5.5mmol/L低糖(NG组)或25mmol/L高糖组(HG组)。

1.3 油红O染色

3T3-L1细胞经“鸡尾酒法”诱导10天后，弃去细胞培养基，用PBS轻柔漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定30min;配制油红O工作液(油红O储存液∶去离子水为3∶2),滤纸过滤，室温下静置10min;将油红O工作液加入细胞中，染色30min,60%异丙醇漂洗，复染，苏木精染色10s,PBS漂洗；甘油明胶封片，显微镜下观察，拍照。

1.4 Westernblot

收集相应处理后的细胞，用预冷PBS清洗细胞3次，每孔加入100μLRIPA细胞裂解液，用刮子刮取细胞，4℃10000r/min离心15min,BCA法测定蛋白水平。总蛋白行10%SDS-PAGE,湿转1.5h至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST37℃封闭1h,加入目标抗体(1∶1000),4℃孵育过夜；冰上回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min,加入相应HRP标记的二抗(1∶5000)37℃孵育1h,再洗膜3次，采用ECL化学发光试剂显色。ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5 实时荧光定量PCR

收集相应处理后的细胞，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA,再经过反转录合成cDNA模板，最后进行荧光定量PCR检测。扩增条件：95℃预变性15min,95℃5s,60℃30s,72℃30s,共40个循环。引物序列：GSDMD上游引物5′-TTCAGGCCCTACTGCCTTCT-3′,下游引物5′-GTTGACACATGAATAACGGGGTT-3′;NLRP3上游引物5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′,下游引物5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′;IL-1β上游引物5′-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3′,下游引物5′-TGCTCATGTCCTCATCCTGGAAGG-3′;GAPDH上游引物5′-ATCATCTCCGCCCCTTCTGC-3′,下游引物5′-ATGCCTGCTTCACCACCTTC-3′。扩增结果采用2-ΔΔCt法计算相对定量。

1.6 CCK-8法

在96孔板中接种细胞悬液，将培养板在37℃、5%恒温孵育箱内预培养24h,向培养板中加入不同浓度CXCL14(终浓度为0、25、50、100、200nmol/L)培养24h,每孔加入10μLCCK-8试剂，培养箱内孵育4h,用酶标仪测定450nm处光密度，计算细胞活力。

1.7 LDH检测

LDH按照试剂盒说明书加样混匀后，室温放置5min,波长450nm,酶标仪测定光密度值并计算。

1.8 AnnexinV-FITC检测

将细胞接种于6孔板，按实验分组处理后，按照试剂盒说明步骤进行细胞荧光检测，荧光显微镜拍照。

1.9 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计分析，对各项计量资料进行正态性检验，符合正态分布以x¯±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HG对脂肪细胞焦亡的影响

3T3-L1细胞形态由梭形逐渐变为圆形，诱导第4天细胞内开始出现小脂滴，诱导第10天90%以上细胞诱导为成熟脂肪细胞，经油红O染色呈红色(图1A)。与NG组比较，HG组GSDMD、NLRP3、IL-1βmRNA转录水平以及NLRP3、Caspase-1、IL-6蛋白表达水平明显升高(P均<0.05),其中NLRP3炎症小体mRNA(P<0.01)及蛋白(P<0.05)变化最明显，分别增加17.7倍、2.9倍(图1B,C,D)。HG环境下，脂肪细胞LDH水平较对照组约升高1.8倍(P<0.01;图1E)。AnnexinV-FITC荧光检测结果显示HG组细胞死亡较高(图1F)。

2.2 HG环境下不同浓度CXCL14对脂肪细胞焦亡的影响

CCK-8结果显示，与CXCL14未干预组(0nmol/L)相比，不同浓度CXCL14对3T3-L1细胞增殖活力有促进作用(P<0.05;图2A)。在HG环境下用0、25、50、100、200nmol/LCXCL14处理脂肪细胞，免疫印迹法及qRT-PCR结果显示不同浓度CXCL14对脂肪细胞焦亡相关蛋白及转录水平存在差异：相较于CXCL14未处理组(0nmol/L),25、100、200nmol/LCXCL14对脂肪细胞焦亡具有促进作用，但是，与之相反的是50nmol/LCXCL14处理组脂肪细胞GSDMD、NLRP3、IL-1βmRNA转录水平及NLRP3蛋白水平呈下调趋势，其中NLRP3炎症小体mRNA及蛋白下调最显著(P<0.01;图2B、C、D)。LDH结果同样显示，除50nmol/LCXCL14处理组LDH释放水平明显下调(P<0.05)外，余处理组较0nmol/L组LDH水平呈上升趋势(P<0.05;图2E);Annexin-VFITC检测同样显示50nmol/LCXCL14处理组细胞死亡率下调显著(图2F)。

2.3 HG环境下CXCL14作用不同时间对脂肪细胞焦亡的影响

选用50nmol/LCXCL14作用不同时间，免疫印迹法结果发现，与CXCL14未干预组(0h)比较，50nmol/LCXCL14干预后焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平呈下调趋势(P<0.05),并且随干预时间的延长呈先下降再升高趋势，其中作用12～24h时NLRP3、Caspase-1蛋白下调最明显(P<0.01;图3)。

3、讨论

糖尿病大血管及微血管并发症是导致2型糖尿病患者致死致残的主要原因[2],由于各个国家医疗支出和治疗手段不平衡，给发达国家与发展中国家均造成巨大财政负担[10]。糖尿病长期高血糖状态会引起机体心脏、眼、肾脏、血管、神经等组织器官和功能的慢性损伤。糖尿病和肥胖时，机体脂肪组织会发生病理性重构，主要表现为脂质蓄积、脂肪细胞肥大、脂肪细胞缺氧、坏死、凋亡，这一系列病理变化激活免疫相关细胞，并刺激脂肪组织分泌和表达炎症因子，共同促进脂肪组织慢性炎症状态[3,4,5]。

细胞焦亡是一种由GSDMD介导的程序性细胞坏死，其特征是NLRP3炎症小体和Caspase-1的激活，细胞膜孔的形成以及白细胞介素-1β和白细胞介素-18的释放[9]。在肥胖症中，脂肪细胞会发生肥大、缺氧或死亡，这可能导致脂肪组织发生严重功能障碍及胰岛素敏感性受损。肥大的脂肪细胞可出现超微结构和生化的改变，包括胆固醇晶体、钙聚集以及活性氧的形成，光镜下可以观察到绝大多数激活的巨噬细胞聚集在死亡脂肪细胞周围形成冠状结构。脂肪细胞这一变化可能触发NLRP3炎症小体，激活大量半胱氨酸蛋白酶-1,最终导致脂肪细胞死于焦亡[11]。Yang等[12]研究发现高糖处理后心肌成纤维细胞焦亡水平较对照组明显升高。Cheng等[13]研究证实高血糖状态激活Caspase-11/4和GSDMD介导的焦亡并参与促细胞的损伤和丢失以及糖尿病肾病的发展。

但是，鲜有研究报道糖尿病病理环境中，脂肪细胞是否发生焦亡以及炎症水平变化。本研究结果发现，体外培养脂肪细胞高糖组GSDMD、NLRP3、IL-1βmRNA转录水平以及NLRP3、Caspase-1、IL-6蛋白表达水平较低糖组明显增加。同样，高糖组脂肪细胞LDH释放水平及AnnexinV-FITC染色细胞死亡率升高更显著。该结果表明高糖暴露环境影响脂肪细胞正常生理状态，且高糖暴露环境下脂肪细胞焦亡发生率升高，该过程可能进一步影响机体糖脂代谢水平，后续研究工作需进一步证实。

CXCL14是CXC趋化因子家族中的一种免疫细胞迁移调节剂，因其特殊的结构及生物学功能，具有潜在的独特作用。多种组织中均有CXCL14mRNA表达。CXCL14对未成熟树突状细胞和自然杀伤细胞的趋化作用可加强机体对恶性肿瘤的免疫屏障。恶性肿瘤组织中CXCL14表达水平下降可能导致肿瘤细胞逃脱机体免疫监视作用[14]。Ignacio等[15]通过比较人类脂肪前体细胞和脂肪细胞的各趋化因子发现，CXCL14在脂肪细胞中升高最显著，并且，相较于其他趋化因子，CXCL14在肥胖人群脂肪细胞中表达最突出。高脂饮食饲养的肥胖小鼠白色脂肪组织和骨骼肌中CXCL14表达上调，肥胖个体CXCL14的表达升高可能与游离脂肪酸水平增加、内质网应激和/或活性氧的增加有关。通过对高脂喂养的雌性CXCL14-/-肥胖小鼠研究发现，CXCL14主要通过招募巨噬细胞至内脏白色脂肪组织和部分抑制骨骼肌胰岛素信号通路两种途径调节糖代谢，骨骼肌中CXCL14能促进白色脂肪组织巨噬细胞迁移，并参与调节葡萄糖代谢[16]。高脂饮食小鼠血浆CXCL14水平明显降低并且与CXCL14表达基因受损有关。Cereijo等[17]通过渗透式微型泵方法使小鼠体内CXCL14处于正常水平时，证实CXCL14可以改善机体葡萄糖平衡，CXCL14通过选择性激活非炎症性巨噬细胞向脂肪组织聚集，从而有利于棕色脂肪活性以及促进白色脂肪棕色化，因此具有耐受胰岛素抵抗和糖耐量异常的保护作用。脂肪组织中CXCL14表达与编码促炎因子的基因的表达呈负相关，与参与糖代谢和胰岛素敏感通路的基因成正相关[8]。

CXCL14对脂肪细胞胰岛素有增敏作用[6]。与之相矛盾的研究发现CXCL14也具有促糖尿病作用[18]。García-Beltran等[19]研究发现患有多囊卵巢综合征的患者中CXCL14低水平状态与由药物诱导的胰岛素敏感性增加有关。CXCL14表达水平可能是肥胖尤其是合并2型糖尿病患者的新型代谢标志物。故本研究以不同浓度CXCL14处理高糖暴露环境下的脂肪细胞，研究发现，在高糖诱导脂肪细胞焦亡模型中，CXCL14可显著增强3T3-L1细胞增殖活力。但是不同浓度CXCL14对高糖环境下脂肪细胞焦亡存在不同效应，不同于其他各组的促焦亡作用，50nmol/LCXCL14处理组脂肪细胞焦亡水平呈明显下调趋势。故本研究选用50nmol/LCXCL14处理脂肪细胞作用不同时间发现，50nmol/LCXCL14干预后脂肪细胞焦亡相关指标蛋白水平下调，干预时间长短影响脂肪细胞焦亡相关蛋白的表达，干预12～24h时蛋白表达水平下调最显著。本研究结果表明适宜浓度CXCL14抑制高糖环境下脂肪细胞焦亡，CXCL14可能是保护脂肪细胞免受HG损伤的潜在靶标，CXCL14浓度及其活性的激活对于维持细胞内环境稳态具有重要意义，探究体内CXCL14有效浓度波动范围、作用时间及CXCL14特异性受体对机体代谢影响十分重要，这将为治疗糖尿病高糖所致机体代谢紊乱提供一个新的研究视角。

综上所述，本研究证实，高糖暴露环境加重脂肪细胞焦亡及炎症水平，CXCL14可影响高糖暴露环境中脂肪细胞的焦亡水平变化。CXCL14可以作为糖脂代谢调节的一个新生物标志物，研究其特异性受体及CXCL14浓度波动范围将对开发新型抗肥胖和抗糖尿病药物具有重要意义。目前CXCL14特异性受体尚不明确，CXCL14对脂肪细胞焦亡调控的具体机制仍有待进一步研究。

文章来源：侯丽娜,刘嘉,李亚兰,孙振,张莉莉,王中群.CXC趋化因子配体14对高糖环境中脂肪细胞焦亡的影响[J].中南医学科学杂志,2022,50(01):7-12.