喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其中喉鳞状细胞癌约占喉癌的90%以上[1]。由于喉癌发病早期无明显不适症状，部分患者在就诊时已发生颈部淋巴结转移和远处转移，使得患者5年生存率不足60%[2]。因此了解喉癌进展中的特异性标志物，对喉癌预防、诊断及预后具有重要意义。泛素化是指泛素分子(ubiquitin, Ub)在一系列特殊酶的作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程[3]。泛素化标记的蛋白或被泛素化降解，或参与基因表达、信号转导、增殖、迁移等细胞进程，与代谢类疾病、肿瘤、心血管疾病的发病密切相关[4,5]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)RP11-214F16.8(更名为Lnc-PCIR)位于13q32.3。近年来研究发现，Lnc-PCIR在乳腺癌中呈高表达，且Lnc-PCIR能够促进乳腺癌细胞增殖及进展[6]。进一步研究发现Lnc -PCIR能够特异性结合多腺苷酸结合蛋白质4[poly(A)-binding protein cytoplasmic 4,PABPC4],抑制PABPC4蛋白的泛素化降解，从而促进三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移，提高裸鼠成瘤和肺转移能力[7]。然而Lnc-PCIR在包括喉癌在内的其他肿瘤中鲜有相关报道。PABPC4是一种RNA结合蛋白。已有研究报道，PABPC4在乳腺癌[8]、结肠癌[9]和肺腺癌[10]中发挥癌基因的作用，且与预后明显相关 。然而在肝细胞癌[11]中，LncRNA RP11-286H15.1通过促进PABPC4泛素化来抑制肝细胞癌进展。GEPIA数据库显示，Lnc-PCIR、PABPC4在头颈鳞状细胞癌中表达升高，且Lnc-PCIR、PABPC4水平与患者预后呈明显负相关，表明Lnc-PCIR、PABPC4可能是治疗喉癌的潜在分子靶点。基于此，本研究拟探讨Lnc-PCIR通过调控PABPC4的泛素化对喉癌细胞增殖、迁移的影响，以期为喉癌治疗提供新的策略。

1、材料与方法

1.1 临床资料与标本采集

收集2018年01月至2022年12月在我院收治的130例喉癌患者的癌和癌旁组织样本及病历资料(包括年龄、性别、解剖分区、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移等)。纳入标准：①病理诊断为喉癌；②术前 未接受放疗及 化疗。排除标准：①临床资料不全者；②伴有其它恶性肿瘤者。本研究经患者知情同意，患者均自愿提供癌及癌旁组织样本。本研究通过我院伦理委员会批准(批号：20220127)。

1.2 细胞、试剂和仪器

人口腔角化细胞(HOK2)、人喉癌细胞(HEP-2、TU212)购自武汉尚恩生物技术有限公司；Lnc-PCIR、 PABPC4引物购自金唯智生物科技有限公司；慢病毒质粒LV-si-Lnc-PCIR及其阴性对照(LV-si-Lnc-NC)、慢病毒质粒LV-Lnc-PCIR及其阴性对照(LV-Lnc-NC)、慢病毒质粒LV-PABPC4及其阴性对照(LV-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；放线菌酮(cycloheximide, CHX)购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司；MG132购自美国Sigma公司；ML364购自美国Selleck公司；兔抗人PABPC4、Ki-67、MMP-9单克隆抗体购自美国CST公司；鼠抗人GAPDH及HRP标记的羊抗兔多克隆抗体购自英国Abcam公司。BiofugePrimoR高速冷冻离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Bio-rad电泳仪、转膜仪购自美国伯乐公司；QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 生物数据库分析

Human Protein Atlas、GEPIA数据库分析头颈鳞状细胞癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4的表达水平。GEPIA数据库分析头颈鳞状细胞癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4水平与患者总体生存期的关系。

1.4 RT-qPCR检测

使用Trizol试剂裂解患者喉癌和 癌旁组织及HOK2、 HEP-2、TU212细胞，提取细胞和组织中的总RNA,使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA (反应条件：42 ℃ 15 min, 95 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min),使用SYBR Green法进行扩增，U6、GAPDH作内参。 反应条件：95 ℃预 变性60 s, 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 40 s, 共35个循环。使用2-ΔΔCT公式 计算Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA相 对水平。 PCR引物序列：Lnc-PCIR-F:5'-GCTGGTAAGAGCGTAGGTGAA-3',Lnc-PCIR-R:GCTTCTTACTGCGGCTTCAT-3';PABPC4-F:5'-ATGAACGCTGCGGCCAGCAGCTACC-3',PABPC4-R:5'-CTAAGAGGTAGCAGCAGCAACAGCG-3';U6-F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3', U6-R:TATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'; GAPDH- F:5'-AACGGGAAGCTTGTCATCAA- 3',GAPDH-R: 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3'。

1.5 细胞转染与分组

所有细胞系在含10%胎牛 血清和1%青/链霉素的 RPMI 1640培养液中培养，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中。HEP-2、TU212细胞分为si-Lnc-NC组(转 染LV-si-Lnc-NC质粒：作为敲低Lnc-PCIR的对照)、si-Lnc-PCIR组(转染LV-si-Lnc-PCIR质粒：用于敲低Lnc-PCIR)、 Lnc-NC组(转染LV-Lnc-NC质粒：作为过表达Lnc-PCIR的对照)、Lnc-PCIR组(转染LV-Lnc-PCIR质粒：用于过表达Lnc-PCIR)、si-Lnc-PCIR+NC组 (转染LV-si-Lnc-PCIR质粒和LV-NC质粒：用于敲低Lnc-PCIR同时作为PABPC4的对照)、si-Lnc-PCIR+ PABPC4组(转染LV-si-Lnc-PCIR质粒和LV-PABPC4质粒：用于敲低Lnc-PCIR同时过表达PABPC4)。根据LipofectamineTM3000说明书，将质粒和LipofectamineTM 3000混合溶液加入HEP- 2、TU212细胞。转染4 h后更换培养基，24 h后RT-qPCR检测Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA水平。

1.6 CCK-8实验

将各组HEP-2、TU212细胞(1×104个)接种于96孔板，于37 ℃、5%CO2条件下培养1 d、2 d、3 d。将原培养基更换成含有10%CCK-8溶液的新鲜培养基，于37 ℃下孵育1 h。检测样品在450 nm处的光密度(optical density, OD) 值。

1.7 EdU染色

将各组HEP-2、TU212细胞(5×105个)接种于96孔板，培养24 h后，每孔加入含50 μmol/L EdU的 培养基孵育 2 h, PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min, 加入2 mg/mL甘 氨酸孵育5 min, PBS清 洗3次，加入0.5%Triton- 100透化10 min, PBS清洗1次，加入100 μL Apollo染色30 min, PBS清洗3次，加入DAPI染色液避光、室温孵育30 min, PBS清洗3次，荧光显微镜(×200)下拍照并计算EdU阳性率。EdU阳性率=EdU阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8 Transwell实验

Transwell小室的上室加入无血清培 养基培养的各组 HEP-2、TU212细胞(2×104个/孔);下室加入含10%胎牛血清的培养基，并置于37 ℃下继续培养48 h。取出小室，拭去未穿过小室的细胞，PBS清洗后，经甲醛溶液固定20 min, 0.4%台盼蓝染色5 min后，显微镜(×200)下观察并统计穿膜细胞数。

1.9 Western blot检测

将各组HEP-2、TU212细胞(1×106个)接种于6孔板，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h, 随后更换无血清培养基继续培养12 h, 饥饿培养后，向培养基中分别加入蛋白质合成抑制剂CHX(终浓度：50 μg/mL,用于抑制蛋白合成)、蛋白酶体抑制剂MG132(终浓度：25 μg/mL,用于抑制蛋白酶体蛋白水解活性)或泛素特异性蛋白酶2(ubiquitin specific proteinase 2,USP2)抑制剂ML364(终浓度：5 μg/mL,用于抑制去泛素化酶USP2)处理16 h, 收集细胞。同时取转染后的各组HEP-2、TU212细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，检测标准品和样品在562 nm处的吸光度，根据标准曲线和样品体积计算样品蛋白浓度。各组取等量蛋白加入上样缓冲液加热，进行SDS-PAGE电泳(电压80 V、电泳30 min, 电压120 V,电泳40 min),采用湿转法将分离的蛋白转至PVDF膜上，脱脂牛奶中封闭2 h, 加入PABPC4一抗(1∶2 000)4 ℃过夜。经TBST洗涤后，加入HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育2 h, 加入ECL显色剂显色，凝胶成像仪拍照，IPP软件进行灰度分析，计 算蛋白相对GAPDH的 表达量。

1.10 动物模型制作及指标检测

将20只裸鼠随机分为si-Lnc-NC组(转染LV-si-Lnc-NC的HEP-2细 胞)、si-Lnc-PCIR组(转 染LV-si-Lnc-PCIR的HEP-2细胞),每组各10只。皮下注射0.2 mL已转染LV-si-Lnc-NC或LV-si-Lnc-PCIR的HEP-2细胞悬液(1×107个/mL)。1个月后处死裸鼠。取部分肿瘤组织，免疫组化染色检测PABPC4、Ki-67、MMP-9蛋白染色情况。步骤如下：肿瘤组织经10%甲醛溶液固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋，制作切片(5 μm),切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，高温抗原修复，3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加3%牛血清白蛋白室温封闭30 min, 加入PABPC4、Ki-67、MMP-9一抗(1∶400)4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗37 ℃孵育1 h, 滴加DAB显色液显色，自来水终止显色，苏木精复染细胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性胶封片，显微镜下观察染色情况。另取部分瘤组织，提取总RNA,RT-qPCR检测Lnc-PCIR水平。

1.11 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，患者临床病理参数为计数资料，以例数表示，多组间比较采用Pearson χ2检验。细胞培养1 d、2 d、3 d OD值、EdU阳性率、细胞迁移数、Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA及各蛋白水平均为计量资料，以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 数据库分析头颈鳞 状细胞癌组织中Lnc-PCIR、 PABPC4的表达情况

Human Protein Atlas数据库显示，头颈鳞状细胞癌组织中PABPC4阳性细胞率>75%,正常组织中PABPC4阳性细胞率<25%(图1A)。GEPIA数据库显示，头颈鳞状细胞癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4表达水平明显高于正常组织，且Lnc-PCIR、PABPC4水平越高，患者生存期越短(P<0.05,图1B)。

2.2 患者喉癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4的表达情况及Lnc-PCIR水平与患者临床病理特征的关系

RT-qPCR、Western blot结果显示，与正常喉组织相比，喉癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05,图2A-B);且Lnc-PCIR、PABPC4二者之间均存在正相关关系(P<0.05,图2C)。分析Lnc-PCIR水平与患者临床病理特征发现，Lnc-PCIR水平与患者性别、TNM分期、肿瘤分化程 度、淋巴结转移有明显相关性(P<0.05,表1)。

2.3 喉癌细胞中Lnc-PCIR、PABPC4的表达情况

RT-qPCR、Western blot结果显示，与HOK2细胞相比，HEP-2、TU212细胞中Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05,图3A、C)。转染HEP-2、TU212细胞后，与si-Lnc-NC组相比，si-Lnc-PCIR组中Lnc-PCIR、PABPC4蛋白水平明显降低(P<0.05),PABPC4 mRNA水平无明显变化(P>0.05);与si-Lnc-PCIR+NC组相比，si-Lnc-PCIR+PABPC4组中PABPC4 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05),Lnc-PCIR水平无明显变化(P>0.05,图3B、D)。

表1 Lnc-PCIR水平与患者临床病理特征的关系n(%) 

2.4 Lnc-PCIR对PABPC4的泛素化调控

首先我们分析了Lnc-PCIR对PABPC4蛋白稳定性的影响，发现经蛋白合成抑制剂CHX处理后，si-Lnc-NC组、si-Lnc-PCIR组、Lnc-NC组细胞中PABPC4水平均有不同程度的降低(P<0.05);而Lnc-PCIR组PABPC4降低程度不显著(P>0.05,图4A),过表达Lnc-PCIRP能够增加PABPC4的半衰期。

图1 数据库分析头颈鳞状细胞癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4的表达   

图2 患者喉癌组织中Lnc-PCIR、PABPC4的表达情况   

图3 喉癌细胞中Lnc-PCIR、PABPC4的表达情况   

随后我们分析了Lnc-PCIR对PABPC4蛋白泛素化降解过程的影响，发现经蛋白酶体抑制剂MG132处理后，各组细胞中PABPC4水平均有不同程度的提高(P<0.05,图4B);其中过表达Lnc-PCIR能够明显抑制PABPC4的泛素化降解过程，促进PABPC4的积累。

最后我们进一步探讨了Lnc-PCIR对PABPC4蛋白泛素化的影响，发现经去泛素化酶USP2抑制剂ML364处理后，si-Lnc-NC组、si-Lnc-PCIR组、Lnc-NC组细胞中PABPC4水平均有不同程度的降低(P<0.05);而Lnc-PCIR组PABPC4降低程度不显著(P>0.05,图4C),过表达Lnc-PCIR能够抑制PABPC4的泛素化水平。提示Lnc-PCIR通过阻断泛素/蛋白酶体依赖性降解途径，提高PABPC4蛋白的稳定性。

2.5 Lnc-PCIR、PABPC4对喉癌细胞增殖、迁移的影响

通过CCK-8实验、EdU染色及Transwell 实验检测Lnc-PCIR、PABPC4对喉癌细胞增殖、迁移 的影响，结果显示，与 si-Lnc-NC组相比，si-Lnc-PCIR组细胞培养1 d、2 d、3 d后的OD值、EdU阳性率明显降低，细胞迁移数明显减少(P<0.05);与si-Lnc-PCIR+NC 组相比，si-Lnc-PCIR+PABPC4组细胞培养1 d、2 d、3 d后的OD值、EdU阳性率明显升高，细胞迁移数明显增多(P<0.05,图5)。

2.6 Lnc-PCIR对裸鼠移植瘤生长的影响

结果显示，与si-Lnc-NC组相比，si-Lnc-PCIR组裸鼠移植瘤体积和质量明显减小(P<0.05,图6A-C),Lnc-PCIR和PABPC4、Ki-67、MMP-9蛋白水平明显降低(P<0.05,图6D-E)。

图4 Lnc-PCIR对PABPC4的泛素化调控   

3、讨论

lncRNA作为致癌或抑癌基因，能够调控肿瘤的发生和转移。LYU等[7]发现Lnc-PCIR在乳腺 癌中表达升高，Lnc-PCIR能够促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和肿瘤发生，在机制上，Lnc-PCIR的致癌特性在于其通过增加SENP3介导的去SUMO化和泛素/蛋白酶体介导的蛋白质降解，抑制肿瘤抑制因子NISCH水平。同样GUO等[12]发现Lnc-PCIR通过阻断PABPC4的泛素/蛋白酶体依赖性降解途径，促进乳腺癌细胞增殖和迁移。然而Lnc-PCIR在喉癌及其他肿瘤中鲜有报道。PABPC4是一种RNA结合蛋白，在基因表达调控中起重要作用。研究发现PABPC4在乳腺癌[8]、结肠癌[9]和肺腺癌[10]中充当癌基因，在肝细胞癌[11]、肾细胞癌[13]中却发挥抑癌作用。可见PABPC4在不同肿瘤中扮演不同角色。数据库分析显示，Lnc-PCIR、PABPC4在头颈鳞状细胞癌中表达升高，且Lnc-PCIR、PABPC4水平与患者预后呈明显负相关，表明Lnc-PCIR、PABPC4可能是治疗喉癌的潜在分子靶点。本研究中， 喉癌组织和细胞系Lnc-PCIR、PABPC4 mRNA和蛋白水平呈现高表达，且组织Lnc-PCIR水平与患者性别、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有明显相关性。在HEP-2、TU212细胞中，敲低Lnc-PCIR能够抑制癌细胞的增殖、迁移；而过表达 PABPC4能部分逆转Lnc-PCIR对细胞恶性行为的抑制效果。同样敲低Lnc-PCIR能抑制裸鼠体内肿瘤生长。说明Lnc-PCIR、PABPC4在喉癌中发挥促癌作用。

图5 Lnc-PCIR、PABPC4对喉癌细胞增殖、迁移的影响   

图6 Lnc-PCIR对裸鼠移植瘤生长的影响  

泛素化与喉癌的发生、发展密切相关。研究发现去泛素化酶USP21在喉癌组织中表达升高，且高USP21水平与喉癌细胞恶性程度及患者不良预后有关[14]。敲低去泛素化酶BAP1水平能够降低喉癌细胞增殖能力，并提高放疗敏感性[15]。本研究发现患者喉癌组织中Lnc-PCIR和PABPC4水平呈正相关；敲低Lnc-PCIR对PABPC4 mRNA水平没有显著影响，但能明显降低PABPC4蛋白水平。为了探究Lnc -PCIR对PABPC4的调控作用，我们首先分析了Lnc-PCIR对PABPC4蛋白稳定性的调控，发现经蛋白合成抑制剂CHX处理后，敲低Lnc-PCIR能够诱导PABPC4降解；而过表达Lnc-PCIR能够减缓PABPC4的降解，说明Lnc-PCIR通过增加PABPC4半衰期，促进其稳定。随后我们分析了Lnc-PCIR对PABPC4泛素化的调控，发现经蛋白酶体抑制剂MG132处理后，过表达Lnc-PCIR能够明显抑制PABPC4的泛素化降解过程，并促进PABPC4的积累。与上述效果一致，经去泛素化酶USP2抑制剂ML364处理后，敲低Lnc-PCIR能够诱导PABPC4降解；而过表达Lnc-PCIRP能够抑制PABPC4降解，说明Lnc-PCIR通过阻断泛素/蛋白酶体依赖性降解途径，提高PABPC4蛋白的稳定性，见图7。

图7 Lnc-PCIR通过调控PABPC4的泛素化对喉癌细胞增殖和迁移的影响   

综上所述，Lnc-PCIR通过调控PABPC4的泛素化促进喉癌细胞的增殖和迁移，Lnc-PCIR可能是治疗喉癌的一个潜在靶点。

参考文献:

[3]吴玉湖,胡欣妍,杨宣叶,等.蛋白质泛素化修饰对流感病毒增殖和致病性的影响[J].病毒学报,2023,39(4):1152-1160.

[6]陈向宙,叶嘉慧,黎谢梦丹,等.长链非编码RNA RP11-214F16.8促进乳腺癌细胞增殖[J].中国生物化学与分子生物学报,2018,34(8):900-904.

基金资助:湖北省武汉市卫生和计划生育委员会科研项目(编号:WZ16Z13);

文章来源:张杨,邓欣欣,王珍等.Lnc-PCIR通过调控PABPC4的泛素化促进喉癌细胞的增殖和迁移[J].现代肿瘤医学,2024,32(07):1228-1235.