甲型流感病毒(influenza A virus, IAVs)给人类带来致命威胁，近十多年来，H1N1、H7N9、H5N1等大规模爆发，给人类健康和经济发展带来严重危害[1]。病毒性肺炎是上呼吸道被病毒感染后，病毒在支气管、细支气管和肺泡上皮细胞中复制，引发支气管和细支气管上皮细胞破裂、坏死，随组织液渗出，并进一步趋化中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞至感染部位，诱发毛细血管损伤，并释放大量炎症因子、活性氧物质，诱发细胞因子风暴[2,3],产生严重的肺组织炎症反应，进而造成弥漫性的组织损伤，致使血管渗漏和肺水肿，使患者缺氧，甚至发生急性呼吸窘迫综合征[4]。

辣木(Moringa oleifera.Lam)又称鼓槌树、奇迹树、洋椿树等，为白花菜目辣木科辣木属的药食两用多年生乔木(图1)。辣木籽为辣木科(Moringaceae)辣木属(Moringa Adans)植物辣木树的种子，具有广泛的食用和药用价值[5]。研究表明，辣木籽中含有丰富的维生素、油脂、蛋白质等营养物质，此外还含有异硫氰酸盐、黄酮、酚酸、生物碱、硫代氨基甲酯等天然活性成分，辣木籽还可用于化妆品、生物柴油及净水的原料，并具有降低血脂、血糖、增强人体免疫、抗炎、抗病毒等生理功能[6,7,8,9,10,11,12]。在抗病毒研究方面，国外有文献报道辣木籽叶提取物对带状疱疹病毒、艾滋病毒和乙肝病毒表现出较好的抑制作用，并且还可用作预防新城疫(newcastle disease, ND)病毒感染，但关键活性成分不清楚[13,14]。

本研究以辣木籽水提物为研究对象，通过其对H1N1诱导的小鼠病毒性肺炎的干预，初步揭示辣木籽水提物的化学组成和对小鼠病毒性肺炎的治疗作用，为辣木籽抗病毒作用和机制研究奠定基础。

图1辣木及辣木籽

1、材料与方法

1.1药品与试剂

辣木籽(批号：20190808,购自义乌市启吉食品有限公司，经遵义医科大学吴发明副教授鉴定为辣木科辣木属植物辣木籽);奥司他韦阳性药(批号：0372108068,购于宜昌东阳光长江药业股份有限公司);乙腈(ACN),规格≥99.9%(质谱级),购自Fisher Chemical公司；甲酸(FA)、甲醇的规格均为98.0%(质谱级),购自Fisher Chemical公司。

1.2实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，体重(20±2 )g,雌雄各半，购于长沙天勤生物技术有限公司，许可证号SCXK(湘)2014-0011,经过遵义医科大学动物使用伦理委员会批准，批准文号ZMU21-2110-001。

1.3病毒与细胞

流感病毒H1N1株购自ProSpec(H1N1 Influenza-A Virus Beijing/262/95)。

1.4仪器

真空离心浓缩仪(德国Eppendorf公司，型号Concentrator plus);分析天平(瑞士Sartorius公司，型号Sartorius BP211d);低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司，型号Microfuge 22R Centrifuge);D1008型掌上离心机(美国Scilogex公司);涡旋仪(美国Scilogex公司，型号MX-S型);全波长酶标仪(Thermo Multiskan Go);水浴锅(ZWY-110X50);超净工作台(Airtech);CO2细胞培养箱(Themo);倒置显微镜(Nikon,型号TS100);超高速离心机(Themo);TripleTOF5600+型质谱仪(AB SCIEXTM厂家生产)。

1.5辣木籽水提物的提取

取干燥辣木籽100 g,粉碎后过80目筛加10倍量水回流提取2次，每次1 h,合并提取液后减压浓缩至体积为100 mL(即100 g药材经提取后浓缩至100 mL提取液，料液相对浓度为1 g/mL),冷藏保存，得辣木籽水提液。

1.6辣木籽水提物的检测

采用液相色谱-质谱法(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)考察辣木籽水提物的成分。

1.6.1液相条件

Waters BEH C18Column色谱柱：(150 mm×2.1 mm, 1.7μm);流动相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)洗脱(0～7 min, 95%A;7～12 min, 70%A;12～14 min, 0%A;14～16 min, 95%A),流速0.3 mL/min,柱温35℃,进样量10μL。

1.6.2质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI源),分别采用正、负离子模式进行检测。ESI源条件如下：气体离子源(Gas 1)为50,气体离子源(Gas 2)为50,气帘气(CUR)为25;离子源温度：正离子500℃,负离子450℃;喷雾电压(ISVF)5 500 V(正离子)和4 400 V(负离子)。质谱采集范围在100～1 200 Da,积离子扫描范围为50～1 000 Da,质谱扫描积累时间0.2 s,积离子扫描积累时间0.01 s,二级质谱采用数据相关采集(IDA)获得，并采用高灵敏度模式，去簇电压(DP)为±60V,碰撞能量为(35±15) eV。

1.7动物实验

SPF级C57BL/6小鼠60只，体重(20±2)g,雌雄各半。经适应性喂养后，按体重随机分为正常组(NOR;正常饲养，不作任何处理)、模型组(MOD;正常饲养，灌胃纯净水)、奥司他韦阳性组(OSE;灌胃给药奥司他韦15 mg/kg)和辣木籽高、中、低剂量组(MOS-H、MOS-M、MOS-L;灌胃给药辣木籽水提物分别为20、10、5 mg/kg),每组10只小鼠。除正常组外，其余各实验组小鼠均用H1N1每天滴鼻感染(10×MLD50,50μL/只),建立流感模型。自实验1 d开始，对各实验组小鼠灌胃给药，连续7 d(8 d停止给药)。实验1 d和7 d分别对各实验组小鼠进行称重。实验9 d将各实验组小鼠断颈处死后剖取肺组织，称重，计算小鼠肺指数，并进行统计学分析。动物实验流程图如图2所示。

图2小鼠实验流程   

1.8检测指标

1.8.1各实验组小鼠体重

分别在实验1 d和7 d对各实验组小鼠体重进行测定，并进行统计学分析，研究药物对病毒感染后小鼠体重的影响。

1.8.2肺组织常规观察

剖取各实验组小鼠肺组织，肉眼观察肺部颜色变化并拍照记录。

1.8.3肺指数测定

实验9 d对各实验组小鼠断颈处死后剖取肺组织，称重，计算小鼠肺指数，并进行统计学分析。

小鼠肺指数(%)=小鼠肺重量小鼠体重×100%

1.8.4肺组织病理形态

用10%的福尔马林溶液固定解剖后的完整肺组织，组织进行常规HE染色，并依据病变的分布、严重程度和形态学特点，使用专业术语将病变分为以下4个等级：轻微、轻度、中度、重度且分别用0、1、2、3表示(0,未见肺组织病理改变，结构正常；1,偶见少许肺组织炎性细胞；2,肺组织炎性细胞较多，明显可见；3,表示肺组织大面积炎性细胞浸润，呈蓝色嗜碱性细胞聚集成片，液体阻塞在肺泡内有呈粉色物质；红细胞充斥肺间质和肺泡，淤血；肺组织实变)。

1.8.5肺组织透射电镜的影响分析

样品经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%(100%浓度中换3次)丙酮逐级脱水，将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液(比例分别为3∶1、1∶1、1∶3),每步30～60 min。Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。

1.8.6肺中炎症因子TNF-α、IL-6水平的影响

取各实验组小鼠肺组织，用PBS匀浆后以1 500 r/min离心10 min,收集上清液，采用ELISA法测定各实验组上清液中(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、(interleukin-6,IL-6)水平。

1.9统计学分析

用SPSS 18.0统计软件进行数据统计分析，计量资料采用均值±标准差(x¯±s)的形式表示，组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用最小显著性差异法(LSD法)进行组间两两比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1辣木籽水提物的LC-MS检测结果

2.1.1辣木籽水提物的LC-MS检测图谱

按“材料与方法1.6.1和1.6.2”项下条件对辣木籽水提物进行分析，正离子模式下的色谱见图3,负离子模式下的色谱见图4。通过与对照品比对及数据解析共确定52个化合物结构，包括氨基酸类8种，萜类8种，黄酮类6种，有机酸类1种，脂肪酸类4种，嘌呤核苷酸3种，多糖2种，二肽类2种，多肽类3种，酰胺类2种，吡喃酮及其衍生物类1种，氯代羟基苯甲醛类1种，羟基肉桂酸1种，间甲氧基苯甲酸及其衍生物类1种，生物碱1种，酚苷1种，苯基哌啶类1种，吲哚类及其衍生物1种，脂肪1种，树脂类2种，苯丙氨酸及其衍生物类1种，姜烯酚类1种。

图3辣木籽水提物正离子色谱   

图4辣木籽水提物负离子色谱   

2.1.2辣木籽水提物的LC-MS检测成分分析

通过Analysis Base File Converter软件将辣木籽水提物的LC-MS检测获得的原始数据转换成ABF格式后将ABF格式文件导入MS-DIAL 4.60 (MS-DIAL:data independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis)软件进行预处理。分析结果显示，从辣木籽水提物中初步鉴定出氨基酸、黄酮、有机酸、萜类、多糖等52种化合物，成分分析如表1,成分分析信息如图5所示。

2.2辣木籽水提物对小鼠体重的影响

如图6所示，通过对实验第1天和第7天各实验组小鼠体重进行统计学分析，发现MOD组、NOR组、OSE组以及MOS-H、MOS-M、MOS-L组小鼠体重均增加，通过比较第7天小鼠体重得知，MOS-L组小鼠体重增加最多，且最为明显，MOS-H组小鼠体重增加最少。

表1辣木籽水提物样品LC-MS成分分析

图5辣木籽水提物成分分析结果   

图6辣木籽水提物对小鼠体重的影响   

2.3肺组织常规观察

如图7所示，NOR组小鼠肺组织呈鲜红色，形态正常。与NOR组相比，MOD组小鼠肺组织血色消失，呈类白色，提示病毒感染后小鼠肺组织产生了明显的炎症病变。与MOD组相比，MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组小鼠肺组织颜色明显红润，无明显白色区域。OSE组小鼠肺组织呈淡红色，无明显白色区域。与MOD组相比，奥司他韦治疗组小鼠肺组织颜色有显著改善。

图7小鼠肺组织解剖结果  

A:正常组小鼠肺组织；B:模型组小鼠肺组织；C:奥司他韦阳性组小鼠肺组织；D:辣木籽高剂量组小鼠肺组织；E:辣木籽中剂量组小鼠肺组织；F:辣木籽低剂量组小鼠肺组织。

2.4辣木籽水提物对小鼠肺指数的影响

肺指数能客观地反映肺炎性病变的变化程度，肺指数值越大，肺炎性病变程度越严重。如图8所示，与NOR组小鼠相比，MOD组小鼠肺指数显著增加(P<0.05);与MOD组相比，MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组中小鼠肺指数均有显著降低(P<0.05);OSE组小鼠肺指数与MOD组比也有显著降低(P<0.05)。

2.5辣木籽水提物对小鼠肺组织病理形态的影响

与NOR组相比，MOD组小鼠肺组织病理评分显著增大(图9A,P<0.01),说明H1N1病毒感染后，小鼠肺组织病理损伤明显加重。与MOD组相比，MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组小鼠肺组织病理评分均有显著减小(图9A,P<0.05),说明辣木籽提取物灌胃治疗后小鼠肺组织病理损伤明显减轻。OSE组小鼠肺组织病理评分较模型组也有显著减小(图9A,P<0.05)。各实验组小鼠肺组织HE染色如图9B所示。NOR组小鼠肺组织肺泡形态完整无损伤，肺泡壁薄，无明显炎性细胞浸润。而MOD组小鼠肺组织病变区内肺泡间隔增宽，结构不完整，间质水肿伴炎细胞浸润，肺泡周围可见大量白细胞。MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组小鼠肺组织上述病变有不同程度减轻。

2.6辣木籽水提物对小鼠肺组织超微结构的影响

如图10所示，电镜下，NOR组小鼠肺泡细胞核膜结构清晰，染色质明显可见。胞浆中可看到结构和轮廓清晰的线粒体、粗面内质网及核糖体。MOD组小鼠肺泡细胞核膜皱褶，核膜变宽，胞浆内线粒体减少且嵴突有断裂和空泡变性，粗面内质网结构不清晰。OSE组小鼠肺泡细胞核膜、线粒体及粗面内质网结构等均有不同程度改善。MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组小鼠肺泡细胞核膜、线粒体及粗面内质网结构等均有不同程度改善。

图8辣木籽水提物对小鼠肺指数的影响   

图9辣木籽水提物对小鼠肺组织病理形态的影响   

图10辣木籽水提物对小鼠肺组织超微结构的影响  

2.7辣木籽提取物对小鼠肺组织炎症因子的影响

与NOR组相比，MOD组小鼠肺组织中TNF-α和IL-6含量均有极显著升高(图11,P<0.01),表明H1N1病毒感染后小鼠肺组织呈现出较严重的炎症。与MOD组相比，MOS-H组、MOS-M组、MOS-L组细胞上清液中TNF-α和IL-6含量均有极显著降低(图11,P<0.01),表明辣木籽提取物治疗后小鼠肺组织炎症因子水平明显降低。

图11辣木籽水提物对小鼠肺组织TNF-α和IL-6含量的影响  

3、讨论

目前国内外对辣木籽抗流感病毒活性及其物质基础并不明确。课题组长期致力于辣木籽抗病毒活性物质基础研究，前期以抗病毒活性为导向对辣木籽中活性成分进行了分离筛选，在辣木籽的非极性溶剂萃取相中获得一些具有抗病毒和抗炎的小分子化合物，如Moringa A、牡荆素、白芥子苷等[15]。本研究主要聚焦于辣木籽中抗病毒和抗炎的大极性成分，通过对辣木籽的水提取物进行LC-MS检测分析发现，萜类和黄酮类成分是辣木籽水提取物中占比较大的天然物质，其他主要是氨基酸、脂肪酸、多糖、嘌呤核苷等营养性物质。一般来说，营养物质的生物活性较低，从成分检测结果可以看出，萜类和黄酮类成分是辣木籽水提取物中发挥抗病毒和抗炎主要活性物质。

流感病毒常引起肺实质炎症，能严重损伤呼吸功能，重者出现呼吸衰竭、肺纤维化、多脏器受损、休克等。流感病毒引起的细胞因子风暴已被证实是引起重症肺炎的关键机制。纠正机体过度炎症反应、恢复免疫平衡是治疗病毒性肺炎，尤其是病毒性肺炎恢复期治疗的主要策略，对于预防和治疗肺组织不可逆损伤、降低重症率和死亡率有重要意义。对流感病毒感染后小鼠的肺组织进行观察发现，病毒感染后，小鼠肺组织不再红润，变得苍白，性状和人类感染流感病毒后肺部组织类似，说明肺是流感病毒侵袭的主要脏器，且病毒会对肺脏组织产生严重损伤。进一步通过HE染色和透射电镜观察发现，流感病毒可损伤肺泡细胞及其内部的染色质、线粒体等重要细胞器，这可能是流感病毒引起呼吸困难甚至衰竭的重要机制。

同时本研究发现，H1N1感染后，小鼠肺组织中TNF-α和IL-6炎症因子水平显著升高，表明流感病毒入侵引发了小鼠剧烈的炎症反应，这种炎症反应是小鼠死亡最直接的原因。同时还观察到，感染的小鼠肺组织发生了严重的病理性损伤，肺部感染明显加剧。辣木籽水提物可显著降低H1N1感染的小鼠肺组织中TNF-α和IL-6水平，说明辣木籽可有效抑制流感病毒引起的小鼠肺组织炎症反应，但详细调控机制有待深入研究。

参考文献:

[1] 李业森,易国良,褚观年,等.辣木籽油在化妆品中的开发优势[J].广东化工,2019,46(12):85-103.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO:82260723);贵州省科技厅科技支撑计划项目[NO:黔科合支撑(2021)一般410];

文章来源:杨梁钰,周显茂,陈磊等.辣木籽水提物对H1N1诱导的小鼠病毒性肺炎的治疗作用[J].遵义医科大学学报,2023,46(08):746-755.