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酒精性肝纤维化核因子κB信号通路与性别的差异

2024-02-18 11 上传者：管理员

摘要：目的探讨酒精性肝纤维化的核因子(NF)-κB信号通路与性别差异的关系。方法将7～8周龄的C57BL/6 N小鼠随机分为：雄性正常组、雄性模型组，雌性正常组和雌性模型组各20只。正常组采用对照液体饲料喂养8周，模型组采用酒精液体饲料喂养8周，联合31.5%乙醇灌胃(每周两次，5 g/kg)建立酒精性肝纤维化模型。8周末处死小鼠，检测各组小鼠血清学谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的活性，雌二醇(E2)和睾酮(T)的水平，天狼星红染色检测各组小鼠纤维化情况，HE染色观察肝组织病理学变化，免疫组织化学法检测NF-κB-P65和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性面积率，免疫印迹法检测Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、磷酸化核因子κB-P65(p-NF-κB-P65)、核因子κB抑制因子α(IκBα)、磷酸化核因子κB抑制因子α(p-IκBα)的表达水平。结果雄性模型组ALT,AST酶活性和T的水平升高，E2的水平降低，胶原纤维增加，HE染色坏死积分升高，NF-κB-P65和α-SMA的阳性面积率增加，collagenⅠ,TNF-α、p-NF-κB-P65、p-IκBα的表达增加，IκBα的表达降低。结论酒精更容易导致雄性小鼠肝纤维化，这可能与加强IκBα磷酸化释放NF-κB,促使磷酸化NF-κB-p65增多，进一步激活NF-κB信号通路有关。

关键词：
ALF
NF-κB信号通路
免疫印迹法
性别差异
酒精性肝纤维化
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酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是乙醇和代谢物作用于肝脏，导致肝组织内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度增生和异常沉积，是各种酒精性肝病发展到酒精性肝硬化的必要阶段，被认为是一个可逆的过程[1]。酒精性肝纤维化存在着明显的性别差异，大量的流病学数据显示，酒精性肝病男性发病率普遍高于女性，约为2.6∶1[2]。有研究表明，雌激素能减轻酒精造成的内毒素血症的免疫反应，同时相关的动物实验证明，当给予去势小鼠一定剂量的雄激素时，酒精性肝损伤明显加重，给予去势小鼠一定剂量的雌激素，酒精性肝损伤症状会减轻[3]。近年来，人们发现核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号通路与酒精性肝纤维化的发生发展过程密切相关，并且有很多文献已经报道雌激素是很多信号通路的调节因子，如 NF-κB 和信号转导与转录激活因子1(signal transducerand activator of transcription 1,STAT-1)[4]。但是酒精性肝纤维化的性别差异与NF-κB信号通路的关系尚不明确。本实验通过酒精诱导构建雌性小鼠和雄性小鼠肝纤维化模型，探讨NF-κB信号通路在酒精性肝纤维化性别差异的作用，为治疗酒精性肝纤维化提供新的思路。

一、材料和方法

1. 实验动物

健康的7～8周龄SPF级雄性和雌性C57BL/6N小鼠，体重为(18～22)g, 来自于北京通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为：SCXK(京)2021-0006。

2. 主要试剂

Lieber-DeCarli酒精液体饲料(TP4030A)和对照液体饲料(TP4030C),南通特洛菲饲料有限公司；谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)/谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；雌二醇(estradiol, E2)和睾酮(testosterone, T)酶联免疫吸附试剂盒，上海钰博生物科技有限公司；一抗小鼠抗β-actin、NF-κB-P65、磷酸化NF-PκB-P65(phosphoryted NF-κB-P65, p-NF-κB-P65)、核因子κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB,IκBα)、磷酸化IκBα(phorphoryted IκBα, p-IκBα)、Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)和α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；HRP标记的山羊抗小鼠二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL超敏化学发光底物试剂盒，上海桥星贸易有限公司；HE染色试剂盒和天狼星红染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；免疫组织化学试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。

3. 实验动物分组和酒精性肝纤维化模型制备[5]5]

选择7～8周龄C57BL/6 N雄鼠和雌鼠随机分组，分为4组：雄性正常组，雄性模型组，雌性正常组，雌性模型组，各20只。其中正常对照组用对照液体饲料(Lieber-DeCarli, TP4030C)喂养8周，饲料热量组成为：蛋白质热量18%,碳水化合物热量47%,脂肪热量35%;模型组用酒精液体饲料(Lieber-Decarli, TP4030A)喂养8周联合31.5%乙醇灌胃(每周两次，5 g/kg),饲料热量组成为：蛋白质热量18%,碳水化合物热量19%,脂肪热量35%,酒精热量28%。

4. ALT、AST、E2和T浓度的检测

小鼠CO2吸入麻醉处死前用眼科镊摘除眼球取血，室温血液自然凝固10～20 min, 以3000 r/min离心10 min, 离心结束后仔细收集上清于新的EP管中并置冰上，使用ALT、AST试剂盒和E2、T的酶联免疫试剂盒进行酶活性和激素水平的检测，具体步骤严格按照说明书进行操作。

5. 肝组织病理学分析

取出小鼠的肝脏，用1×PBS冲洗肝脏表面的血，放在4%多聚甲醛中固定24～48 h, 进行常规石蜡切片及包埋，进行天狼星红染色和HE染色，观察肝细胞坏死和肝纤维化程度。Axio Observer3荧光显微镜观察每组组织坏死情况，摄片保存。肝细胞坏死率得分统计方法，显微镜100倍视野下观察坏死率，0级：未见坏死；1级：1至2处坏死；2级：2处以上坏死；3级：大片坏死区域。

6. 免疫组织化学染色

先将组织切片进行常规脱蜡水化的处理；滴加内源性过氧化酶阻断剂于组织上，37 ℃温箱中孵育15 min; 用PBS洗3遍，每1遍5 min; 使用煮沸法进行抗原修复后，于1×PBS中浸泡15 min; 进行血清封闭后，使用一抗(NF-κB-P65∶PBS=1∶200,α-SMA∶ PBS=1∶200)封闭，4 ℃过夜；第2天滴加二抗生物素标记山羊抗小鼠IgG(生物素∶PBS=1∶200)室温孵育10～15 min; 之后滴加三抗，HRP标记链霉卵白素工作液(卵白素∶PBS=1∶100)室温孵育10～15 min; DAB显色后，置于苏木精中进行细胞核染色，然后用自来水冲洗返蓝；最后用中性树胶进行封片。

7. Western blotting检测

首先将小鼠的肝组织进行进行研磨，提取组织蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测各组蛋白的浓度，计算好上样体积后，开始上样，进行电泳，电泳结束后进行电转，电转结束后洗膜，奶粉封闭1 h, 一抗(β-actin∶ PBST=1∶1000,NF-κB-P65∶PBST=1∶1000, p-NF-κB-P65∶PBST=1∶1000,IκBα∶PBST=1∶1000,p-IκBα∶PBST=1∶1000,collagenⅠ∶PBST=1∶1000, TNF-α∶PBST=1∶1000)4 ℃孵育过夜，第2天冰箱拿出来洗膜，二抗(山羊抗小鼠∶PBST=1∶2000)孵育 1 h, 洗膜，使用ECL化学发光液曝光摄片和图片保存。以β-actin作为内参，使用软件Gel-Pro Analyzer 4.0对目的条带进行分析，并计算相对表达量。

图1 不同组小鼠血清ALT(A)和AST(B)的酶活水平

8. 统计学处理

使用SPSS 25.0统计学软件对实验数据进行分析，数据以均值±标准差表示，多组间进行比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异具有显著统计学意义，P<0.01为差异具有极显著的统计学意义。

二、结果

1. ALT和AST酶活性检测结果

与雌雄对照组相比，雌雄模型组ALT、AST酶活性显著升高；与雌性模型组相比，雄性模型组的ALT、AST酶活性明显升高(P<0.05或P<0.01,图1A,1B)。

2. E2和T浓度的结果

与雌雄对照组相比，雌雄模型组的血清E2和T浓度降低；与雌性模型组相比，雄性模型组E2的浓度降低，T的浓度升高(P<0.05或P<0.01,表1)。

3. 胶原纤维天狼星红染色结果

与雌雄对照组相比，雌雄模型组胶原纤维含量增加；跟雌性模型组相比，雄性模型组中胶原纤维含量增加明显，分布更加广泛(P<0.05或P<0.01,图2)。

4. 肝组织HE染色结果

雌雄正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝索排列十分均匀，肝细胞形态相对完整；雌性模型组小鼠肝小叶的结构不清晰，肝索排列出现紊乱，肝细胞呈现轻微的气球样变；雄性模型组小鼠肝小叶结构破坏，纤维组织广泛增生，将肝小叶分割成大小不等的假小叶，假小叶内肝细胞肿胀变大，胞质疏松呈气球样变。与雌雄对照组相比，雌雄模型组小鼠HE染色坏死积分升高；与雌性模型组相比，雄性模型组坏死积分升高(P<0.05或P<0.01,图3)。

表1 血清雌二醇(E2)和睾酮(T)浓度的酶联免疫测定

图2 胶原纤维天狼星红染色

图3 肝组织HE染色

图4 NF-κB-P65的免疫组织化学染色图

图5 α-SMA的免疫组织化学染色图

5. 免疫组织化学染色结果

雌雄正常组小鼠肝组织中的NF-κB-P65和 α-SMA 的阳性数目几乎没有，而雌雄模型组中NF-κB-P65 和α-SMA的阳性数目要比正常组的多；跟雌性模型组相比，雄性模型组中NF-κB-P65和α-SMA的阳性数目明显增多，说明在酒精性纤维化模型中，雄性小鼠NF-κB-P65和α-SMA的表达比雌性小鼠显著增加(P<0.05或P<0.01,图4,5)。

6. 免疫印迹法检测蛋白表达结果

与雌性模型组相比，雄性模型组collagen Ⅰ,TNF-α,p-NF-κB-P65,p-IκBα的表达升高，IκBα的表达降低(P<0.05或P<0.01);说明使用酒精液体饲料联合31.5%乙醇灌胃后，雄性小鼠炎症反应明显，TNF-α表达增加，通过加强IκBα磷酸化释放NF-κB,促使磷酸化NF-κB-p65增多，进一步激活NF-κB信号通路，使得纤维化程度更明显，见图6。

图6 免疫印迹法检测不同组小鼠肝脏collagenⅠ、TNF-α、p-NF-κB-P65、IκBα及p-IκBα的表达

三、讨论

酒精性肝纤维化(ALF)是在乙醛的持续刺激下，导致肝脏内纤维组织增生，细胞外基质(ECM)的合成大于降解，使肝内ECM过度沉积的病理过程。期间肝星形细胞(HSC)被激活，表达α-SMA,活化的HSC可分泌大量的ECM,促进I型胶原蛋白合成[6]。在临床工作中，人们发现在酒精性肝纤维化中，男性的发病率明显高于女性，并且男性患者肝纤维化进展速度快，个体存活时间短，女性患者肝纤维化进展速度慢，个体存活时间长，这可能与体内的雌雄激素水平有关[7]。一项研究发现，在大鼠酒精性肝纤维化模型中，给予雄激素的去势大鼠肝纤维化比给予雌激素的去势大鼠的严重，肝细胞坏死也更明显，淋巴细胞浸润也更重。雌鼠组与雄鼠组比较，雌性动物肝纤维化显著较轻[8]。另1项研究在二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化中，给雄性大鼠注射不同剂量的雌激素可以抑制肝纤维化，其雌激素剂量与肝纤维化成反比[9]。

NF-κB是一种具有转录激活功能的蛋白质，同时在细胞质中存在NF-κB抑制物IκB蛋白。IκBα与NF-κB结合以无活性的形式存在于细胞质中，在受到各种因素的刺激时，IκB被蛋白激酶磷酸化而被蛋白酶降解，NF-κB即被激活，进入细胞核与相应的靶基因结合，启动基因转录，从而发挥调节细胞功能的作用[10]。NF-κB参与调节免疫反应及炎症的过程，促进炎症因子TNF-α,IL-6等的表达，这些因子也可激活NF-κB,进一步放大炎症反应[11]。研究表明，雌激素抑制NF-κB-p65与炎症因子基因的启动子结合及转录活性，会干扰NF-κB-p65从胞质到胞核的转位[12]。这可能就是NF-κB信号通路在酒精性肝纤维化性别差异的作用。

本实验通过Lieber-DeCarli酒精液体饲料联合31.5%乙醇灌胃制造模型后，第8周末雄鼠的ALT、AST明显高于雌鼠，ALT和AST是反映许多慢性肝脏疾病严重程度的生物标志物[13]。当发生肝细胞损伤时，造成细胞膜的通透性大大增加，进而导致血清中两种酶活性急速升高，其异常升高可引起肝细胞损伤和坏死[14]。ELISA结果显示，肝纤维化组中E2和T的水平较正常组是下降的，雄性模型组雌激素浓度远低于雌性模型组，雌性模型组中雄激素的浓度几乎为零，说明肝纤维化中雄激素浓度下降程度远高于雌激素，性激素的血清浓度变化与肝纤维化有紧密联系。天狼星红染色结果显示，雄性模型组的胶原纤维含量增多，分布范围更加广泛，说明雄性模型组小鼠肝纤维化更严重。HE染色结果显示，雌雄正常组小鼠肝组织的结构正常；雌性模型组小鼠肝组织开始出现纤维组织和轻微的肝细胞肿大；雄性模型组小鼠肝组织出现了广泛增生的纤维组织肝细胞肿胀变大，呈气球样变，细胞坏死更加明显。NF-κB-P65和α-SMA的免疫组织化学结果显示，雄性8周末组的阳性面积明显多于雌性8周末组，说明了在酒精性肝纤维化中，雄鼠的肝纤维化程度要比雌鼠重。Western blotting结果显示，与雌性模型组相比，雄性模型组的TNF-α、collagenⅠ、p-NF-κB-P65 和p-IκBα的表达量明显增加，IκBα的表达明显降低，说明酒精更容易导致雄性小鼠肝纤维化，与雌性小鼠相比，雄性小鼠炎症反应更明显，TNF-α表达增多，使更多的IκBα磷酸化并释放 NF-κB, 将NF-κB-P65磷酸化，进一步激活NF-κB信号通路。

酒精性肝纤维化中存在明显的性别差异，虽然肝脏并不是一个典型的性激素靶器官，但在肝脏中是有雌雄激素受体的，雄激素是体内重要的促纤维化因子，雌激素是体内重要的对抗纤维化的因子，所以，性激素在肝纤维化中起着一定的作用[15]。雌激素可能抑制了NF-κB信号通路的某个节点的变化，这为临床治疗肝病，制定个性化的治疗方案提供了新思路[16]。综上所述，酒精性肝纤维化有明显的性别差异，且NF-κB信号通路表达的变化及意义与其密切相关。

基金资助:国家自然基金(82170606);中原科技创新领军人才计划项目(214200510004);洛阳市科技计划项目(2101028A);河南省高等学校重点科研项目计划基础研究专项(23ZX006);

文章来源:洪晓敏,李三强,崔钦奕等.酒精性肝纤维化核因子κB信号通路与性别的差异[J].解剖学报,2024,55(01):55-61.