牛呼吸道疾病综合征(BRDC)是由多种细菌和病毒感染以及环境应激因素之间相互作用引起牛的呼吸道疾病。最早报道发生于育肥肉牛，感染病牛的病原并非单一，常同时感染或携带多种病原，缺少典型症状，且传统治疗方案效果不佳。由于各种病原引起的临床症状相似，很难通过临床症状进行判定[1,2,3]。因此运用实验室检测特别是分子生物学方法对病原进行鉴定，可对BRDC的临床治疗以及合理预防提供指导性作用。现将引起BRDC的主要病原及检测方法概述如下，供参考。

1、引起BRDC的主要病毒

1.1牛冠状病毒

牛冠状病毒(BCoV)属于冠状病毒科，乙型冠状病毒属，a亚群，线状单股正链RNA病毒。目前国内普遍认为该病毒是引起犊牛腹泻的重要病原，也可以引起成年牛的冬季血痢，且易发生混合感染[4]。BCoV引起的呼吸道疾病通常表现为亚临床型，多见于12～16周龄犊牛，出现轻度呼吸道症状，如鼻炎、咳嗽和喷嚏，也可侵害下呼吸道。该病毒是在肠道及上呼吸道上皮内复制的1种环境致病性病原，饲养管理不当、严寒湿润、应激等因素可促使牛群发生BCoV感染，常出现地方流行性，被感染的牛场几年内可连续发生，临床上难以净化。我国对BCoV的研究比国外晚，其流行病学报道也相对较少。姚火春等[5]1990年对北京、安徽、南京等地的6个奶牛场进行血清学检测，BCoV抗体阳性率高达80.2%。沈付娆等[6]2013—2014年对山东、天津、河南等地的5个牛场采集107份鼻拭子进行检测，发现BCoV阳性率为51.28%。杨海峰等[7]2017年对我国14个省奶牛养殖量较大的29个规模化牧场进行犊牛(未断奶)呼吸道疾病综合征评估，初步证实BCoV是引发犊牛呼吸道综合征的主要病原之一，且大多呈隐性或亚临床感染。根据国内的检测结果显示，青海、四川、新疆、西藏等牛主产区的BCoV感染较为普遍和严重，血清抗体阳性率大多在80%以上，病原学阳性率普遍在60%以上[8]。

1.2牛疱疹病毒1型

牛疱疹病毒1型(Bovineherpesvirus-1,BHV1)属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，水痘疱疹病毒属，是由20面体核衣壳和脂蛋白外膜相连组成的近似球形、带囊膜的双链DNA病毒[9]。我国于上世纪80年代初在进口的种牛中发现并分离鉴定了该病毒。BHV1感染发病率高，死亡率低，但在继发细菌性支气管肺炎或者同时有牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)或牛呼吸道合胞体病毒(Bovinerespiratorysyncytialvirus,BRSV)感染时，死亡率明显增高[1]。BHV1最大的特点是组织嗜性广，除经常侵害呼吸系统外，还能侵害生殖系统、神经系统、眼结膜和胎儿。牛在感染初期通过直接接触传播该病毒，康复牛或某些免疫牛也会由于自然和人为的应激因素重新排毒而无临床症状。其潜伏感染特性是难以根除的主要因素。目前我国大部分省(市、区)的各种牛群中均有此病毒感染，其中山东、河北、内蒙古、北京、河南、新疆等地牛血清学检测阳性率为28%～86%;四川省牛血清学检测阳性率为10%～60%;内蒙古地区发生牛传染性鼻气管炎的牛群中BHV1血清学阳性率最高达89.55%[10]。邹世颖等[11]从北方地区(山东、河北、内蒙古、北京、河南、新疆)的14个牛场采集成年牛血清进行ELISA检测，结果显示被检牛群均有BHV1感染，血清阳性率为56%，发病率为20%～100%，奶牛继发性流产有时高达50%，死亡率为1%～12%。

1.3牛呼吸道合胞体病毒

牛呼吸道合胞体病毒(Bovinerespiratorysyncytialvirus,BRSV)属于副黏病毒科，肺病毒亚科，肺病毒属，可引起牛和其他反刍动物的急性呼吸道疾病。BRSV为单链负股有囊膜的RNA病毒(长15kb)，不含血凝素和神经氨酸酶。潜伏感染不是BRSV的主要特点(与BHV1相比)，但可引起持续感染或携带于长距离运输的动物[12]。引起持续感染的作用机制目前尚不清楚，也不能解释持续的二次感染使牛的免疫力下降，有可能是由于病毒长期存在于带毒动物的淋巴或其他组织中。在没有急性感染或引进新动物的情况下，暴发该病毒的感染主要是由于带毒动物的长期存在，如肉牛在哺乳期暴发的“夏季肺炎”。其危害性在于感染发病率很高，达到60%～80%，死亡率在一些暴发病例中也能达到20%以上[13]。我国在2007年首次分离到BRSV，随后在全国各地均有检测到该病毒抗体的报道[14]。2014、2015年广西各地不同规模牛场BRSVIgG抗体平均阳性率为36.73%[15];2017年新疆南疆地区规模化牛场的BRSV抗原平均阳性率为25%[16]。

1.4牛副流感病毒3型

牛副流感病毒3型(Bovineparinfluenza-3virus,BPIV3)属于副黏病毒科，呼吸道病毒属，有囊膜结构，基因组为单股负链RNA(全长约15kb)，不同基因型病毒间的核酸长短有差异[17]。病毒基因组编码6个结构蛋白，包括核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)、基质蛋白(M)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(F)。该病毒仅感染牛，多见于集中肥育牛，放牧牛少有发生。该病毒广泛分布于世界各地，晚秋和冬季是感染的常发季节，被感染的病牛通常只会造成吸道上皮受损，但会导致多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体等病原体侵入患病牛的呼吸道，加重病情甚至引起肺炎，增加病牛的死亡率。2008年我国首次从病牛鼻拭子中分离出BPIV3，全基因组序列测定及进化树分析表明，该分离株为1种新的基因型(命名为BPIV3基因C型)[18]。2013年王海勇等[19]报道，从黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南、福建12个省(区)采集的牛血清样品(2489份)通过血清中和试验进行BPIV3抗体检测，结果BPIV3抗体平均阳性率为77.6%，其中江西省阳性率为27.8%，其他省(区)阳性率均高于50%，有2/3的省(区)阳性率超过80%，福建省阳性率高达100%。2014年相关工作人员用血清中和试验检测黑龙江省牛血清BPIV3抗体，阳性率为97.06%[18]。

1.5牛病毒性腹泻病毒

牛病毒性腹泻病毒(Bo-vineviraldiarrheavirus,BVDV)属于黄病毒科，瘟病毒属，与猪瘟病毒和边界病病毒为同一属，有抗原交叉反应[20]。该病毒可感染牛、羊、猪等多种家畜和野生反刍动物，但以牛为主。感染牛表现为发热、白细胞减少、腹泻、流产、黏膜糜烂溃疡等急性症状及小牛先天持续性感染[21]。感染该病毒的青年牛死亡率可达20%以上，也可引起母牛繁殖障碍。常通过病牛的分泌物及排泄物、血液等，以直接接触或间接接触的方式经消化道和呼吸道感染，也可由胎盘垂直感染。1980年郑志刚等[22]首次从国外引进牛的流产胎儿中分离并鉴定出BVDV。2013年童钦等[23]对内蒙古自治区集约化养牛场进行病毒性腹泻感染情况调研，结果显示乌兰浩特、巴彦淖尔、呼和浩特3个地区的BVDV阳性率分别为77.80%、48.70%、33.33%，总血清阳性率为58.35%。2018年孟庆森等[24]调查显示，内蒙古通辽、林西和吉林九台、安徽阜阳、山东聊城、江苏徐州等地区的451份样品阳性率为78.5%。

2、引起BRDC的主要病菌

2.1溶血性曼氏杆菌

溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)无芽孢，属于有荚膜和菌毛的革兰氏阴性菌，分为A、T2个生物型及17个血清型，是引起牛羊等反刍动物呼吸系统疾病的病原之一。A生物型溶血性曼氏杆菌可致奶牛急性败血症和肺炎，其发病率和病死率分别为9%～40%和25%～50%[25]。该菌是导致牛出血性肺炎的主要致病菌，临床症状以发热、咳嗽、呼吸急促、流鼻涕为特征，严重可以引起肺炎和败血症导致牛死亡。随着养牛业的规模化发展，其造成的危害越来越严重，给养牛业带来很大的经济损失。该菌感染不分季节、品种和性别，但气候变化、冷热交替、断奶应激、长时间运输、饲料改变、不同来源的牛处在同一环境等因素易感染暴发(又称为“运输热”)[26]。我国新疆、内蒙古、甘肃、黑龙江、云南、广西等地均有病例报道。感染牛一般2周左右会出现典型的肺炎，潜伏期最短为1～3d。感染该菌的牛若处理不当，还会继发感染多种病原，如多杀性巴氏杆菌、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒等[27]。

2.2多杀性巴氏杆菌

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是1种革兰氏阴性、中央微凸的球杆菌，多散在，不能运动，不形成芽孢。该菌分为3个亚种、5类荚膜型以及16种血清型。A型多杀性巴氏杆菌为牛鼻、咽部的常在菌，同时也是引起BRDC的最常见病原菌[28]。牛多杀巴氏杆菌病的发生无明显季节性，常呈散发性或地方流行性。在寒冷、潮湿、长期高温高湿、拥挤、通风不良、疲劳运输、饲料突变、营养缺乏、饲养管理不良时，机体对外界抵抗力降低，有很高的感染发病概率，并且引起其他并发症。根据临床表现不同常分为急性败血型、浮肿型、肺炎型3种。急性败血型表现体温升高，精神沉郁，呼吸、脉搏加快，眼结膜潮红，食欲废绝，反刍停止，腹部触诊疼痛;粪便初为粥样，后呈液状，并混杂黏液或血液。肺炎型为最常见类型，主要表现纤维素性胸膜肺炎症状，体温升高，呼吸困难，伴有干咳，鼻内有泡沫状或脓性鼻液;肺部听诊有支气管呼吸音和水泡性杂音;眼结膜潮红。浮肿型除上述全身症状外，特征症状为颌下、喉部肿胀，有时伴有急性结膜炎;皮肤和黏膜发绀，呈紫色，常因窒息或下痢虚脱而死[29]。

2.3化脓隐秘杆菌

化脓隐秘杆菌(Arcanobateriumpyogenes)是1种革兰氏阳性、无运动性、无芽孢、短棒状细菌，好氧或兼性好氧，在5%～10%CO2环境条件下或添加血液、血清的培养基中可促进其生长。化脓隐秘杆菌在血琼脂培养基上培养24h，可见白色针尖状菌落，且周围有直径比菌落大2～3倍的β型溶血环。化脓隐秘杆菌是隐秘杆菌属中广泛流行的1种，是牛羊等的重要体内条件致病菌，存在于各组织、黏膜中，从健康动物的乳腺、泌尿生殖道和上呼吸道中该菌的检出率最高可达100%[30]。作为肠道共生菌，化脓隐秘杆菌的感染往往是内源性的，可以引起牛皮肤、关节和器官的化脓性感染，如流产、脓肿、关节炎、乳腺炎、肺炎、精囊炎以及子宫感染导致的不育等。该菌还常常与牛支原体、厌氧菌、大肠杆菌、链球菌等混合感染，从而加重病情[31]。

2.4昏睡嗜血杆菌

昏睡嗜血杆菌(Histophilussomni)是1种共生性革兰氏阴性细菌，多数菌株在全血培养基上可形成溶血带;在5%牛血培养基中于37℃、5%～10%CO2条件下生长良好，呈无色或灰色透明菌落。感染后引起牛发生败血症，可导致脑膜炎、滑膜炎、胸膜炎和肺炎[32]。就目前的资料来看，昏睡嗜血杆菌易感动物主要是牛，国内目前尚未见相关病例报道[33]。临床症状按表现不同分为生殖道型、呼吸道型、败血型和其他型。感染牛初期表现体温升高，气喘咳嗽，同时发生浆液性鼻涕，采食减少或者停止，经过3～5d表现出严重的呼吸困难，常常卧地不起，发生腹泻或排出血样粪便，体况消瘦，最后由于衰竭而死亡。解剖病死牛可见只有胸腔与肺部发生病变，肺膈叶、心叶和尖叶均发生不同程度的红色肉变，肺间质明显变宽，且存在不同大小的干酪样黄白色坏死灶;气管以及支气管内存在大量的乳白色泡沫;胸腔只存在少量积液，但心包积水，为黄色清亮液体[34]。

3、病原的实验室检测

3.1病料采集

采集病牛呼吸道分泌物或病变组织作为检测病料。

3.2细菌检测

(1)镜检:无菌条件下将采集的新鲜病料直接涂于载玻片上制成涂片，经革兰氏等染色后进行镜检。(2)细菌分离培养:在无菌条件下用接种针钓取少量病料样品，涂布或者划线接种在相应培养基上，37℃培养24～48h，观察菌落生长特性，并进行分离菌鉴定(见表1)。

表1牛呼吸道疾病综合征细菌性病原的检测

3.3病毒检测

用采集的病料进行病毒基因组提取，用相应病毒的特异引物进行PCR扩增检测病毒目的基因(见表2)。

表1牛呼吸道疾病综合征病毒性病原的检测

3.4诊断

根据病牛的临床症状、病理变化，结合细菌和病毒检测鉴定结果，综合分析判断病牛感染病原。

4、小结

近年来，我国肉牛和奶牛产业快速发展，并且肉牛养殖作为我国的产业扶贫项目之一，在西南和西北贫困地区大力发展。根据国内不同地区的相关报道，BRDC给我国养牛业造成了很大的经济损失。由于BRDC的病原多为混合感染，治疗难度大，所以积极防控成为控制该病的主要方法，关键在于快速诊断、有效预防和合理治疗。随着多重PCR、实时荧光定量PCR等快速诊断方法的出现，准确诊断为有效防控提供了条件。在我国实施重大动物疫病强制免疫的政策支持下，许多疫病的防控已经取得了不错的效果。对于BRDC这种多种病原混合感染的疫病，疫苗的制备显得至关重要，现阶段对于BRDC主要病原的研究已经取得了很大进展，但是国内对于相关病原的疫苗研制仍较滞后，需要加大这方面的力度，为BRDC防控奠定基础。

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基金:“乙型脑炎病毒PrM/E和NS1蛋白表达及免疫原性研究”青年教师国家自然科学基金培育项目建议资助项目(黔科合平台人才[2017]5788-70);“猪乙型脑炎病毒强毒株和弱毒株prM-E､NS1和NS1-NS2A基因真核表达差异的研究”贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字[2015]33);“牛呼吸道疾病综合征快速PCR检测技术”贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2018]2265);“乙型脑炎病毒强､弱毒主要结构蛋白真核表达差异及其免疫原性研究”贵州省2016年科学技术基金(黔科合基础[2016]1048)