血液凝固是一个复杂的过程，它涉及多种血浆蛋白、血小板和血管壁的相互作用[1]。因此，制备具有快速止血，且对人体没有细胞毒性的促凝材料一直是生物医学领域的研究热点。近年来，无机纳米技术在血液凝固领域的应用受到了广泛关注。无机纳米材料因其独特的物理化学性质，如高比表面积、良好的生物相容性和易于表面修饰等[2],为血液凝固提供了新的可能性。无机纳米材料的表面通常具有高度活性，能够与血液中的凝血因子、血小板等成分发生相互作用，这种相互作用可以促进凝血因子的激活和聚集，从而加速血液凝固过程。TiO2作为常见的无机纳米材料，在生物医学领域具有广泛的应用前景[7-8]。TiO2具有较强的稳定性和较大的比表面积，其表面含有很多羟基，可以与氨基酸中的羧基结合在一起，形成较为稳定的结构[9]。

凝血酶是血液凝固过程的关键一步，具有高效止血功能[3]。凝血酶的提取比较复杂，市场上售卖的凝血酶冻干粉价格较高，并不适宜作为一种普遍的止血产品。凝血酶是一种生物活性物质，必须在低温下储存，常温条件下的凝血酶非常容易失活[4]。因此，凝血酶不宜直接用于常规的血液促凝。血液中含有大量的凝血酶，抗凝血浆在结合钙离子后会产生大量凝血酶，使血浆凝固[5]。正常人1mL血浆含凝血酶原约300单位，在凝血时通常可以全部激活转化为凝血酶[6],但血浆中也有很强的抗凝血酶活性。因此，如何有效地利用血浆中产生的凝血酶使其不被大量抗凝血酶抑制具有重要意义。

本研究选择TiO2作为血浆的载体，使血浆中产生的凝血酶负载在TiO2上，制备TiO2/血浆凝血酶促凝血材料，并研究它们对血液促凝效果的影响，同时，也探讨TiO2/血浆凝血酶在常温条件下长时间储存后促凝效果的变化。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

冷冻干燥机(SCIENTZ-10N,宁波新芝生物科技股份有限公司);超声波清洗机(SB25-12DTDN,宁波新芝生物科技有限公司);HH-1智能数显恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司);粉末X射线衍射仪(XRD-6100,日本岛津);傅里叶变换红外光谱仪(港东FTIR-650,天津科技发展股份有限公司);比表面积分析仪(NOVAtouch美国康塔仪器公司);高压灭菌锅(DZF-6030,上海一恒科学仪器有限公司);恒温鼓风干燥箱(DHG-9030A,上海一恒科学仪器有限公司);离心机(JJ-1,江苏金坛区城东新瑞仪器厂);紫外可见分光光度计(UV-1800 PC,青岛精诚仪器仪表有限公司);洁净工作台(SW-CJ-IG,苏净集团国泰公司);二氧化碳细胞培养箱(Forma 310,美国赛默飞世尔科技公司);荧光倒置显微镜(IX51,日本奥林巴斯);台式超纯水机(UPT-11-10T,四川优普超纯科技有限公司);酶标分析仪(318C+,上海沛欧仪器有限公司)。

TiO2(P25购自德国德固赛Degussa公司);兔血浆、凝血酶发色底物S-2238、凝血酶、活化部分凝血酶时间(APTT)检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司);凝血酶原时间(PT)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);胰酶、L929培养基、PBS缓冲溶液、Hoechst 33342染色液、PI染色液、MTT试剂盒(武汉普诺赛生命科技有限公司);无水氯化钙(阿拉丁试剂上海有限公司);无菌采血针、枸橼酸钠采血管(威海赛威医疗科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1材料制备方法

(1)新鲜血浆的制备。

将家兔仰卧固定在手术台上，在心脏部位备皮，用碘伏消毒皮肤，选择心搏最明显处刺入无菌采血针，见回血后另一头插入枸橼酸钠采血管。待取得所需血量后，迅速将针头拔出摇匀采血管，防止血液凝固。在3000r/min条件下，离心10min,收集上层清液，转移至无菌离心管中，即为缺血小板新鲜血浆(PPP)。

(2)TiO2/血浆凝血酶制备。

取无水氯化钙3.4333g溶入1L的去离子水中，制备出25mmol/L的CaCl2溶液，取4mL溶液加0.3g TiO2,搅拌、超声，制备出TiO2/CaCl2溶液。取4mL PPP加入TiO2/CaCl2溶液中，在37℃水浴锅温育30min,离心、洗涤重复3次，放入冷冻干燥机中冷干、研磨，得到TiO2/PPP(TiO2/P)凝血粉。

1.2.2凝血酶原时间(PT)实验

取0.01g TiO2/P粉溶于4mL PT凝血活酶溶液中记为溶液a,分别取0.14mL溶液a与0.07mL PPP置于37℃水浴锅中，温浴3min。将二者混合，立即计时，重复倾斜试管，记录液体停止移动的时间。实验重复3次。

1.2.3活化部分凝血酶时间(APTT)实验

取TiO2/P 10mg溶于4mL CaCl2(25mmol/L)溶液，在37℃水浴锅中温浴。将APTT鞣花酸溶液平衡至室温，颠倒混匀。取0.1mL APTT鞣花酸溶液加入0.1mL PPP中，在37℃水浴锅中5min混匀。取0.1mL TiO2/P CaCl2加入混合液中，立即计时，置于37℃水浴锅中不断振荡，约30s时取出，观察纤维蛋白丝出现时间，实验重复3次。

1.2.4不同浓度的TiO2/P对血浆的促凝效果

以25mmol/L CaCl2溶液为溶剂，分别制备0、1、2、5、10、15mg/mL的TiO2/P溶液，并与血浆1∶1混合，测量凝血时间，实验重复3次。

1.2.5体外全血凝固时间测定

取家兔心脏全血，注入枸橼酸钠抗凝采血管中，摇匀，防止血液凝固，制备出枸橼酸钠抗凝全血。分别取TiO2、TiO2/P 10mg溶于4mL CaCl2溶液中，吸取2mL TiO2和TiO2/P溶液，分别加入37℃2mL的枸橼酸钠抗凝全血中，每隔10s倾斜离心管，记录血浆凝固所需时间，实验重复3次。

1.2.6 TiO2/P中凝血酶含量的测定

把1KU凝血酶和凝血酶显色底物S-2238分别溶于PBS(pH=7.4,0.1mol/L)中，制备出30、60、120、250、500U/mL的凝血酶溶液，S-2238的浓度为8×10-5mol/L。取1mL不同浓度的凝血酶和1mL S-2238混合，在37℃水浴锅中10min,离心，用紫外分光光度计在405nm处测定吸光度，制备出凝血酶的标准曲线。取10mg TiO2/P溶于1mL PBS并加入1mL S-2238,在37℃水浴锅中离心10min,用紫外分光光度计在405nm处测定吸光度，根据标准曲线计算出凝血酶的含量。

1.2.7溶血率实验

取2mL兔抗凝全血，加入2mL生理盐水，在3000rpm下离心10min,去除上清液，加生理盐水，离心，去除上清液，重复2次，得到红细胞。加入生理盐水稀释制备出2%的红细胞悬液。把TiO2/P溶于生理盐水配制成10、20、50、100μg/mL的溶液。在不同浓度的TiO2/P溶液中加入1mL红细胞悬液，在37℃水浴锅离心1h,用紫外分光光度计在540nm波长下测定上清液的吸光度。以生理盐水作为阴性对照组、去离子水作为阳性对照组，溶血率计算公式如下：

1.2.8细胞毒性试验

MTT法检测L929细胞活力，钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)/Hoechst 33342染色液检测L929细胞凋亡。把L929细胞接种于96孔板和6孔板中，放入90% DMEM高糖培养基于5%CO2、37℃培养箱中培养。分别在96孔板中加入TiO2、TiO2/P,使其浓度为0、25、50、100、200μg/mL,对照组加入等体积的L929培养基，培养24h后加入MTT液体进行测试。在6孔板中分别加入50μg/mL的TiO2、TiO2/P,置于5%CO2、37℃培养箱中培养24h,然后加入Calcein-AM/PI/Hoechst 33342进行三染测试，并使用倒置荧光显微镜观察细胞活力，实验重复3次。

1.3统计学方法

数据采取平均数±标准差表示，Turkey多重比较方法进行单因素方差分析。P<0.05代表具有统计学差异。

2、结 果

2.1样品的表征

图1a为TiO2介孔材料的比表面积(BET)图。TiO2的比表面积为41.85m2/g,这可以为血浆中的凝血因子提供更多的附着位点。图1b所示，TiO2晶面在25.28°、37.80°、48.05°、53.98°、55.18°、62.65°、68.9°、70.29°、75.1°分别对应锐钛矿型的(101)、(004)、(200)、(105)、(211)、(204)、(116)、(220)、(215),晶面在27.44°、36.14°、41.18°的衍射峰归属于金红石相的(110)、(101)、(111)面[10]。TiO2/P表面由于血浆凝血酶的负载，峰的强度减弱。图1c红外光谱(FTIR)分析，TiO2在663cm-1范围出现宽的振动带，该宽振动带为Ti-OH的特征吸收带[11-12],3428cm-1和1650cm-1左右为水分子中-OH的弯曲振动和伸缩振动峰、TiO2/P在1542cm-1处出现了N-H弯曲振动及C-N的伸缩振动峰、酰胺Ⅱ带，同时1650cm-1处吸收峰与水分子中-OH峰重叠在一起，这是由于凝血酶中仲酰胺(-CO-NH-)中-C=O的特征峰，对应着酰胺Ⅰ带[13]。从图1d可以看出TiO2是一种纳米颗粒，在与复钙血浆结合后，会使TiO2形成TiO2/P聚集物，如图1e所示。

图1 TiO2和TiO2/P的表征图

2.2凝血酶含量、APTT、PT时间分析

图2a为不同浓度凝血酶的紫外吸收图，S-2238可被凝血酶催化水解，释放出发色基团对硝基苯胺(pNA),pNA可在405nm波长处检测到，由此可以制备出凝血酶标准曲线(图2b)。如图2c所示，TiO2/P在405nm处测定吸光度值为2.0863。根据标准曲线计算出每10mg TiO2/P中凝血酶含量约为76U。图2d为TiO2/P的浓度与凝血效果的关系，在浓度为10mg/mL时，对血浆的促凝效果达到最好。

如图2e所示，TiO2/P的APTT时间为(26.0±1.0)s,相比于对照组(34.5±0.5)s, TiO2/P凝血剂均可以显著降低活化部分凝血酶时间，这也表明TiO2/P凝血剂存在内源凝血途径。血浆中有大量的凝血酶等凝血因子负载到TiO2中，在TiO2/P与血液接触时，凝血因子快速释放，加速凝血。如图2f所示，TiO2/P凝血粉的PT时间为(17.0±0.3)s,相比于对照组(22.0±0.3)s, TiO2/P凝血剂可以显著降低凝血酶原时间，这也表明了TiO2/P凝血粉可以在凝血过程中，对外源性凝血途径起到良好的促进作用。

图2 TiO2/P中凝血酶的负载率及凝血效果图

2.3 TiO2/P的体外全血凝固时间分析及溶血率分析

体外全血凝固时间实验可以有效地测试材料的凝血性能，如图3a所示，TiO2、TiO2/P对全血凝固都有促进效果，TiO2/P的血液促凝效果最好，在201s左右就可以使全血完全凝固。如图3b所示，TiO2/P分别在室温下放置0、7、14、28d之后测试其体外全血凝固时间分别为(201±6)s、(212±3)s、(225±3)s、(232±4)s,这也表明了TiO2与血浆结合后可以保持其表面产生的凝血酶在经过长时间的保存后，仍能保持较高的凝血活性，这也为该材料运用于临床提供了支持。图3c表明TiO2/P在不同浓度下的溶血率均小于1%,说明TiO2/P即使在较高浓度下对红细胞的细胞形态也无明显影响。

图3 TiO2/P对全血的促凝效果及溶血率图

2.4细胞毒性结果

使用Calcein-AM/Hoechst 33342和PI染色剂可以观察L929细胞凋亡情况。在倒置荧光的观察下(图4),与对照组相比，TiO2、TiO2/P在50μg/mL的浓度下均没有表现出明显的细胞毒性。MTT结果所示(图5),TiO2在0～100μg/mL的浓度范围内，对L929细胞的生长抑制几乎没有影响。负载了血浆凝血酶的TiO2纳米颗粒TiO2/P也没有表现出明显的细胞毒性，随着纳米材料浓度增加，其对细胞的活力抑制也逐渐增加，但细胞整体活力仍高于90%。

图4 AM/PI/Hoechst 33342染色检测L929细胞凋亡

图5不同浓度TiO2、TiO2/P培养L929细胞的MTT图(n=3)

3、讨 论

用枸橼酸钠制备的血浆在与钙离子接触时会重新触发凝血，在凝血过程中会产生大量的凝血酶，这些凝血酶被吸附在纳米材料表面，形成稳定的纳米凝血材料。TiO2凝血效果可能与血小板在其表面吸附、聚集，形成血凝块，加速血液凝固有关[14]。TiO2/P的凝血效果更强，除了纳米材料本身的促凝效果，其表面负载的凝血酶在与血液接触的过程中可以促进凝血级联中的内源性和外源性凝血，从而加速全血的凝固。本实验结果表明，TiO2/P对血液的溶血率低于1%,这表明了其具有良好的血液相容性；TiO2/P在常温下放置28天后仍可保持较高的促凝活性，这表明了该凝血材料具有较好的稳定性；细胞毒性实验表明TiO2、TiO2/P均无明显细胞毒性，这说明血浆中的凝血酶负载到纳米材料中，并不会增加纳米材料对细胞的毒性，表明了该凝血材料的安全性。TiO2/P具有快速凝血、稳定性、血液相容性、安全性等特点，这为其临床应用提供了可行性。因此，TiO2/P纳米材料在快速血液促凝方面有很大的应用前景。未来，将进一步研究TiO2/P的凝血机制和应用范围，为临床止血治疗提供新的有效手段。

参考文献:

[5]赵文秀,马骏,王志晓,等.铭悦茜白片对小鼠出血､凝血､血浆复钙时间及血小板计数的影响[J].甘肃中医药大学学报,2020,37(1):37

[6]王庭槐.生理学[M].第9版.北京:人民卫生出版社,2018:77

[9]李云龙.止血材料开发及其表面功能蛋白研究[D].浙江:浙江大学,2014

基金资助:湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队项目(T2020022); 咸宁市科技研究与开发(高新类研发重点专项)项目(2021GXYF021); 湖北省大学生创新创业训练计划项目(S201910927021); 湖北科技学院科学发展基金(2021ZX01,2022FH09);

文章来源:刘坤,唐冬旭,张洋林,等.TiO2负载血浆凝血酶的制备及其对血液快速促凝性能的研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(05):384-388.