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RAS突变的幼年型粒单核细胞白血病患儿遗传学特点和临床分析

2025-05-29 69 上传者：管理员

摘要：目的探讨伴有RAS突变的幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia, JMML）的基因组特征和预后因素。方法回顾性分析2008年1月—2022年11月中国医学科学院血液病医院诊治的具有RAS突变的JMML患儿的临床资料。结果共纳入34例患儿，其中单纯NRAS突变17例（50%），单纯KRAS突变9例（27%），复合突变8例（24%）。与NRAS单纯突变的患儿比较，NRAS复合突变的患儿发病年龄、血小板计数及胎儿血红蛋白比例等方面差异有统计学意义（P<0.05）。Cox比例风险回归模型分析显示，造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）和肝大（≥肋下2 cm）是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素（P<0.05）；肝大是影响非HSCT组JMML患儿生存率的因素（P<0.05）。结论 NRAS复合突变患儿发病年龄晚于NRAS单纯突变患儿。NRAS复合突变患儿在初诊时，外周血小板和胎儿血红蛋白情况较NRAS单纯突变患儿更差。初诊时肝脏大小与RAS突变JMML患儿预后有关。HSCT可改善RAS突变JMML患儿预后。

关键词：
JMML
RAS突变
临床特征
儿童
幼年型粒单核细胞白血病
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幼年型粒单核细胞白血病(juvenilemyelomonocyticleukemia,JMML)是好发于婴幼儿期的罕见克隆性血液系统恶性肿瘤,表现为外周血单核细胞明显增高,骨髓和肝脾异常粒单核细胞浸润[1]｡绝大多数JMML患儿存在RAS/MAPK信号通路相关基因变异[2]｡异基因造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)是目前JMML的唯一治愈性方法,但由于移植后复发率高及严重并发症发生率高,其长期生存率仅为50%[3]｡JMML是由于RAS/MAPK通路信号转导异常和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)所引起,导致血液系统恶性克隆对GMCSF敏感性增加[4]｡根据目前发表的最大的3个JMML临床队列,在408例JMML患儿(欧洲175例､日本135例､北美98例)中,380例(93%)的JMML患儿携带RAS/MAPK信号通路基因突变,包括PTPN11､NF1､CBL､NRAS､KRAS基因的胚系或体细胞突变｡NRAS突变和KRAS突变都是典型的肿瘤相关RAS突变,NRAS突变通常发生于G12､G13或G61位点,KRAS突变通常发生于G12和G13位点[5-6]｡RAS突变导致RAS蛋白及下游通路异常激活,从而导致疾病发生[7],这两种突变是JMML临床上较为常见的突变基因类型,但临床特征及疾病进展､转归具有一定异质性,目前研究尚有限｡故本研究回顾性分析了具有RAS突变JMML患儿的遗传学特点与临床特征,旨在探索RAS突变JMML的基因组学特征与预后因素｡

1、资料与方法

1.1研究对象

回顾性分析2008年1月—2022年11月在中国医学科学院血液病医院诊治的具有RAS突变JMML患儿的临床资料｡纳入标准:(1)符合2016版世界卫生组织的JMML诊断标准[8]的初诊患者;(2)年龄0~14岁;(3)携带NRAS和/或KRAS基因突变｡排除标准:(1)排除其他克隆性血液系统恶性肿瘤,如骨髓增生异常综合征､急性髓系白血病､慢性粒细胞白血病等;(2)排除其他引起外周血单核细胞增高的疾病,如单核细胞增多症;(3)排除其他肿瘤,如淋巴瘤､消化系统肿瘤等;(4)排除JMML转化为其他髓系肿瘤的患者｡本研究获得中国医学科学院血液病医院伦理委员会的批准(伦理审批号:IIT2021-EC-1),且所有患儿及家属均知情同意｡

1.2研究方法

1.2.1基因检测方法纳入的患儿均完成JMML突变基因检测,其中18例完成JMML经典基因热点突变检测,16例进行血液肿瘤基因组二代测序(next-generationsequencing,NGS)检测｡热点突变检测方法:取患儿骨髓4mL,乙二胺四乙酸抗凝,根据基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA,并将DNA标本进行PCR扩增｡选取目的基因为JMML5个经典基因,包括PTPN11(外显子2､3､4､7､8､12､13､14)､NRAS(外显子2､3､8､9)､KRAS(外显子2)､NF1(外显子35)和CBL基因｡构建针对JMML5个经典基因文库｡NGS方法:提取患儿骨髓标本中基因组DNA,采用NGS方法检测血液肿瘤相关的112个基因编码区的点突变和插入/缺失突变,平均测序深度为2000×｡对携带JMML经典基因突变的患儿使用一代测序法检测口腔黏膜DNA进行验证,以确定是胚系或体细胞突变｡

1.2.2核型检测方法采用G显带法进行骨髓染色体核型分析,采用荧光原位杂交对部分异常染色体核型进行验证｡

1.2.3甲基化测序方法使用IlluminaInfiniummethylationEPICBeadchip平台(Illumina)对DNA甲基化进行定量｡所有JMML样本中可变CpG位点分为3个等级,分别为低甲基化､中甲基化和高甲基化｡

1.2.4随访通过查阅患儿电子病历(住院病历和门诊病历)及电话随访,随访截止日期为2023年1月30日或患儿死亡｡随访主要内容包括患儿性别､年龄､实验室检查､基因检测､治疗情况､生存情况和复发情况｡

1.3统计学分析

使用SPSS22.0软件对数据进行处理｡分类变量以百分率(%)或构成比表示,组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法｡计量资料以中位数(范围)表示,采用非参数秩和检验Mann-WhitneyU检验｡采用Kaplan-Meier法进行生存分析｡将单因素Cox比例风险回归分析中P<0.10的所有变量纳入多因素Cox比例风险回归模型｡采用多因素Cox比例风险回归模型分析JMML患儿预后的影响因素｡P<0.05被认为具有统计学意义｡

2、结果

2.1一般特征

本研究共纳入34例患儿,中位发病年龄14个月(范围:3~60个月),男女性别比为3.86∶1｡RAS突变的JMML患儿均存在脾大,中位脾脏大小为肋下5cm(范围:2~16cm)｡与NRAS单纯突变的患儿比较,NRAS复合突变的患儿发病年龄更大､血小板计数(plateletcount,PLT)更低､胎儿血红蛋白(fetalhemoglobin,HbF)更高,差异有统计学意义(均P<0.001)｡见表1｡1例NRAS合并KRAS复合突变的患儿发病年龄为31个月,女性,初诊时脾脏大小肋下3cm,肝脏大小肋下1cm,WBC计数42.5×109/L,血红蛋白(hemoglobin,Hb)69g/L,PLT73×109/L,HbF2%｡

11例患儿(32%)行HSCT治疗,均为半相合HSCT,其中NRAS单纯突变者3例,NRAS复合突变2例,KRAS单纯突变者3例,KRAS复合突变3例｡23例患儿(68%)未行HSCT治疗｡

表1RAS突变的JMML患儿的临床资料

2.2遗传及分子学特征

纳入的34例患儿中,携带NRAS单纯突变17例(50%),KRAS单纯突变9例(27%),NRAS合并PTPN11突变3例(9%),KRAS合并PTPN11突变2例(6%),NRAS合并KRAS突变1例(3%),KRAS､PTPN11和NF1复合突变1例(3%),NRAS､PTPN11和NF1复合突变1例(3%)｡继发突变有EP300(2例),以及FAT1､TET2､FAN46C､JAK3､TRAF3､NOTCH1､IL7R､IKZF1和ARID1A(各1例)｡

共28例患儿完成染色体核型检测,其中19例为NRAS突变,8例为KRAS突变,1例为NRAS合并KRAS突变｡19例NRAS突变患儿中有2例为单体7核型,1例为其他异常核型,16例无核型异常｡8例KRAS突变患儿中有1例为其他异常核型,7例无核型异常｡1例NRAS合并KRAS突变患儿为其他异常核型｡

共11例患儿完成DNA甲基化水平检测(8例为NRAS突变患儿,2例为KRAS突变患儿,1例为NRAS合并KRAS复合突变患儿)｡8例NRAS突变患儿中,4例为中甲基化水平,4例为高甲基化水平｡2例KRAS突变患儿中,1例为中甲基化水平,1例为高甲基化水平｡1例NRAS合并KRAS复合突变患儿为高甲基化水平｡

18例NRAS突变患儿完成突变位点检测,其中G12D位点突变4例(22%),G13D､G12S､G13A位点突变各3例(17%),Q61H､Q61R､G12A､Q61K､G13D合并Q61H位点突变各1例(6%)｡10例KRAS突变患儿完成突变位点检测,其中G13D位点突变5例(50%),G12A､G12V､G60V､G21D､A59T合并T56I位点突变各1例(10%)｡见图1｡

图1JMML患儿NRAS和KRAS突变的位点

2.3生存分析

2.3.1总体生存情况及生存分析34例具有RAS突变的JMML患儿2年总体生存(overallsurvival,OS)率为43%±11%,NRAS突变组2年OS率为33%±14%,KRAS突变组2年OS率为46%±18%｡中位生存期为11.5个月(范围:1~102个月),中位随访时间13个月(范围:1~102个月)｡纳入患儿共死亡15例,其中13例未行HSCT治疗,均死于疾病进展;2例行HSCT治疗后死亡,1例于HSCT后8个月死于肺部感染,1例死于HSCT后排异反应｡

行HSCT治疗的患者OS率显著优于未行HSCT治疗的患者(82%±10%vs44%±12%,P=0.037)｡NRASHSCT组的患儿OS率高于NRAS非HSCT组(80%±8%vs47%±13%,P=0.031),KRASHSCT组的患儿OS率高于KRAS未HSCT组(83%±9%vs33%±10%,P=0.044),见图2B｡NRAS单纯突变､NRAS复合突变､KRAS单纯突变和KRAS复合突变患儿生存曲线见图2C｡

图2生存曲线

2.3.2影响RAS突变的JMML患儿的单因素及多因素分析在纳入的RAS突变患儿当中,单因素Cox分析显示,行HSCT治疗是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素(P=0.035)｡多因素Cox分析显示,行HSCT治疗(P=0.009)和肝大(≥肋下2cm,P=0.018)是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素｡见表2｡

在未行HSCT治疗的RAS突变患儿当中,单因素Cox分析显示,肝大､初诊PLT<40×109/L是影响未行HSCT的RAS突变的JMML患儿生存率的因素(P<0.05)｡多因素Cox比例风险回归模型分析结果显示,肝大是影响未行HSCT的RAS突变的JMML患儿生存率的因素(P<0.05)｡见表2｡

表2RAS突变的JMML患儿生存率的单因素及多因素Cox分析

3、讨论

JMML是一种婴幼儿罕见的造血干细胞克隆性疾病,以粒系及单核系细胞异常增殖为特征,并常伴红系与巨核系发育异常[9]｡JMML临床表现异质性较大,通常表现为发热､乏力､脾大和血小板减少[10]｡本研究中携带RAS突变的JMML患儿主要以肝脾大为最常见临床症状和体征｡本研究发现NRAS复合突变的患儿发病年龄显著大于NRAS单纯突变患儿,并且外周血PLT和HbF等情况较NRAS单纯突变患儿差｡根据既往研究报道的预后因素,提示本研究中的NRAS复合突变的患儿携带较多预后不良因素,其预后应该差于NRAS单纯突变患儿｡但本研究中发现两组患儿之间的预后并无显著性差异,这可能与本研究纳入的患儿时间跨度大,早期并没有规范成熟的治疗方案有关[4]｡

近年来,JMML基因组学和表观遗传学研究取得了重大进展｡基因突变的发现有助于提高诊断准确性,预测患儿临床预后,并给予最佳治疗策略[11]｡JMML的发病机制与RAS/MAPK通路基因突变相关｡根据目前的研究,90%以上的JMML患儿可检测出JMML经典基因突变,包括PTPN11､NF1､CBL､NRAS､KRAS基因突变[12]｡既往研究发现,JMML中NRAS突变和KRAS突变患儿数大致相当[13],但本研究中NRAS患儿占比相较于既往报道偏高,可能与早期患儿采取一代测序,遗漏部分突变位点有关｡

由于JMML恶性程度高,进展迅速,如果不及时治疗,多数患儿死于疾病进展或继发感染｡并且JMML患儿对化疗反应差,目前尚未发现有效的化疗药物[14]｡本研究中RAS突变的JMML患儿2年OS率为43%±11%,最常见的死亡原因是疾病进展和继发感染｡有研究发现某些NRAS突变的JMML患者可自发缓解并且在未行HSCT治疗的情况下长期存活[15]｡但对于大部分携带NRAS突变以及所有携带KRAS突变的JMML患儿建议诊断明确后应立即行HSCT治疗[16]｡

既往研究提示JMML患者初诊年龄≥24个月,PLT计数<40×109/L､HbF增高为预后不良因素[17]｡在本研究中发现肝脏≥肋下2cm是影响RAS突变的JMML预后的因素,这可能由于肝脏大小能反映JMML肿瘤负荷,肝脏越大代表肿瘤负荷越高,从而导致患儿预后不良｡但本研究并未发现脾脏大小和RAS突变的JMML患儿预后之间存在关联,这可能是由于患儿初诊时年龄跨度大,不同年龄的儿童脾脏正常大小不同,并且同一年龄的正常儿童脾脏大小也可能不同[18]｡因此,对于不同的JMML患儿,脾脏肋缘下大小可能不能准确反映患儿的真实肿瘤负荷｡

既往研究报道RAS突变的JMML患儿预后还可能与DNA甲基化水平相关[12,19]｡本研究中完成甲基化水平检测的患儿共11例,由于完成DNA甲基化水平检测的患儿太少,尚无法提供有力的甲基化水平影响JMML患儿生存的证据｡本研究发现NRAS突变和KRAS突变的位点占比最高的为G12和G13位点的突变,与既往研究[5]报道一致｡既往研究报道KRAS突变的JMML通常存在单体7核型[20],但本研究中完成核型检测的KRAS突变患儿中并未发现单体7核型,这可能与样本量太小有关｡

本研究病例资料是单中心数据,时间跨度大,且数量有限,这是本研究的不足之处｡在早期病例中,由于对疾病认识不足,一些患者无法得到及时诊断,相关检查也并不完善｡目前,JMML的诊断标准逐渐明确,医疗技术不断提高,对JMML的认识也在不断突破,JMML的诊断和治疗将更加准确和有效｡

参考文献:

[1]杨文钰,刘立鹏,刘芳,等.63例幼年型粒单核细胞白血病的临床特征与预后分析[J].中国当代儿科杂志,2023,25(3):265-271.

[9]刘晨梦,杨文钰.幼年型粒单核细胞白血病预后指标研究进展[J].国际儿科学杂志,2023,50(12):810-814.

基金资助:国家自然科学基金(82270144);中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-003､2023-I2M-C&T-B-106､2021-I2M-1-041,2022-I2M-1-022);卫生健康发展促进项目-汇宇肿瘤研究基金项目(008);

文章来源:陈云龙,汪星辰,刘晨梦,等.RAS突变的幼年型粒单核细胞白血病患儿遗传学特点和临床分析[J].中国当代儿科杂志,2025,27(05):548-554.