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免疫性血小板减少症患者外周血CD4+CD28-T细胞数量功能分析

2024-12-12 106 上传者：管理员

摘要：目的：研究免疫性血小板减少症（ITP）患者外周血CD4+CD28-T细胞比例及功能，深入了解ITP的发病机制。方法：选取2021年1月至2022年6月于大连医科大学附属第二医院就诊的ITP患者30例及30例性别、年龄匹配的健康人作为对照，收集外周抗凝血提取单个核细胞（PBMC），流式细胞术分析PBMC中CD4+CD28-T细胞比例及功能，ELISA检测ITP患者血浆中IL-18、IL-18BP含量，IL-18刺激PBMC，流式细胞术检测IL-18刺激前后CD4+CD28-T细胞比例。结果：ITP患者外周血CD4+CD28-T细胞比例明显高于健康对照组，且IFN-γ和TNF-α分泌能力更强；ITP患者血浆中IL-18含量上调；IL-18刺激可提高ITP患者PBMC中CD4+CD28-T细胞比例。结论：ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例升高，分泌炎症因子的能力更强。

关键词：
CD4+CD28-T
IL-18
ITP
促炎因子
免疫性血小板
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免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种自身免疫性出血性疾病[1]。ITP发病机制复杂，研究报道ITP中CD4+T细胞向Th1极化，Th1/Th2失衡，Th1相关促炎因子IFN-γ分泌增加；Tregs数量减少和免疫抑制功能缺陷，免疫耐受失衡。因此CD4+T细胞数量及功能异常在ITP发病中发挥核心作用[2-3]。CD4+CD28-T细胞是一群免疫衰老相关细胞，虽然CD28表达缺失，但并非呈现无能状态。研究表明CD4+CD28-T细胞具有分泌促炎因子IFN-γ、TNF-α的能力，还表达自然杀伤细胞受体，产生细胞毒相关分子如穿孔素和颗粒酶B，在病毒感染及一些自身免疫性疾病中起致病作用[4]。ITP中CD4+CD28-T细胞的数量及功能尚不明确。

T细胞所处环境对T细胞分化影响很大，细胞因子作为免疫微环境的重要组分之一，在调节免疫应答中起重要作用。研究报道ITP患者中IL-18含量增多，且与IFN-γ呈正相关[5]。IL-18归属为IL-1家族成员，通过与受体结合发挥作用。IL-18Rα是IL-18的结合位点，但二者结合亲和力很低，只有招募IL-18Rβ形成高亲和力复合物信号才能传递。IL-18Rα受体表达广泛，而IL-18Rβ表达局限，仅在T细胞和树突状细胞表达。人体内存在IL-18的天然拮抗剂即IL-18结合蛋白（IL-18 binding protein,IL-18BP），可与IL-18高亲和力结合，从而竞争阻断IL-18与其受体结合，IL-18的作用取决于体内两者比例即未结合的IL-18。IL-18对T细胞作用广泛，但对CD4+CD28-T细胞亚群的作用尚不明确[6-8]。

本研究在体外分析初发ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例及功能，进一步探究IL-18对CD4+CD28-T细胞的影响，利于深入理解ITP的发病机制及可能的治疗靶点。

1、资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料

选取2021年1月至2022年6月于大连医科大学附属第二医院就诊的ITP患者30例，男12例，女18例，中位年龄48(16～89）岁，血小板数（1～33）×109L-1，诊断标准根据成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南（2020年版）[9]，排除结缔组织病、甲状腺疾病、病毒感染、药物因素所致继发性血小板减少。为避免药物影响，入组患者均选取初发患者，未应用任何ITP相关治疗用药。同时选取30例性别、年龄相匹配的健康体检者作为对照（healthy control,HC）。本研究经大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准（大医二院伦快审2023第253号），所有参与者知情同意。

1.1.2试剂与仪器

淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；抗人CD4-FTIC、CD28-PE、CD154(CD40L)-PE-Cy7、IFN-γ-APC、TNF-α-APC、Perforin-APC及Cell Fixation&Permeabilization Kit固定破膜剂购自美国Biolegend或e Bioscience公司；流式细胞仪（Novo Cyte2060R）为安捷伦公司产品；anti-CD3抗体（OKT3）、重组人IL-18/IL-1F4蛋白和人IL-18 ELISA检测试剂盒购自美国R&D systems；人IL-18BP ELISA检测试剂盒购自南京森贝伽生物有限公司。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞（peripheral blood mono-nuclear cell,PBMC）分离

取ITP患者及HC EDTA抗凝血2 ml，加入等体积PBS稀释，淋巴细胞分离液分离，按说明书将稀释后的抗凝血加至分离液上方，体积比为1∶1,800 g离心20 min，提取白膜层，即为PBMC。

1.2.2流式细胞术检测PBMC中表型及功能分子

PBMC用PBS洗涤后，加入相应细胞膜表面抗体CD4和CD28，室温避光孵育30 min,PBS洗涤，流式细胞仪检测。需预先向细胞中加入PMA、离子霉素、BFA使终浓度为50 ng/ml、1µg/ml、10µg/ml，培养3 h后检测IFN-γ。流式细胞术检测IFN-γ和Perforin时，按上述方法先加入膜表面抗体，根据说明加入破膜剂破膜后，再加入IFN-γ和Perforin抗体，流式细胞仪检测，Novo Express软件分析结果。

1.2.3细胞培养

将提取的PBMC用含10%FBS的RPMI1640培养液重悬，接种于24孔板，加入antiCD3抗体3µg/ml，加或不加IL-18(100 ng/ml），培养72 h，收集细胞。

1.2.4蛋白芯片检测ITP患者和HC血浆中细胞因子水平

5个ITP患者外周血浆样本，每例患者各取100µl均匀混合成1管血浆样本，同时准备5个HC血浆样本各500µl，蛋白芯片试剂盒检测血清中440种细胞因子水平，委托广州瑞博奥公司检测。实验结束后，激光扫描仪Inno Scan 300 Microarray Scanner扫描荧光信号，AAH-CYT-G5软件进行数据分析。

1.2.5 ELISA检测血浆中IL-18和IL-18BP

收集ITP患者及HC血浆，ELISA检测血浆中IL-18和IL-18BP水平，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3统计学处理

采用Graph Pad Prism 9.0软件进行统计分析并作图，样本比较采用独立样本t检验或配对t检验，数据以xˉ±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例升高

流式细胞术检测ITP患者及HC外周血中CD4+CD28-T细胞比例，结果显示：与HC相比，ITP患者PBMC中CD4+CD28-T细胞占CD4+T总细胞比例明显升高[（25.130±3.175)%vs (12.400±1.988)%,P=0.002 9，图1]。

2.2 ITP中CD4+CD28-T细胞IFN-γ和TNF-α分泌能力更强

流式细胞术分析CD4+CD28-T细胞部分功能，结果显示（图2）：与HC相比，ITP患者CD4+CD28-T细胞分泌更多的IFN-γ和TNF-α[IFN-γ:(34.580±5.018)%vs (14.930±3.061)%,P=0.003 6;IFN-γ(MFI):8 483±1 196 vs 4 117±673,P=0.005 2;TNF-α:(45.420±5.633)%vs (23.640±3.494)%,P=0.004 1;TNF-α(MFI):20 900±4 166 vs 10 863±2 136,P=0.046]；而分泌穿孔素及表达CD40L的细胞比例无明显差异。两组CD4+CD28-T细胞与CD4+CD28+T细胞比较分泌IFN-γ、穿孔素的能力更强；而CD40L阳性细胞比例在CD4+CD28-T细胞中低于CD4+CD28+T细胞。HC中CD4+CD28-T细胞较CD4+CD28+T细胞分泌TNF-α的能力更强，ITP患者CD4+CD28-T细胞和CD4+CD28+T细胞分泌TNF-α阳性细胞比例虽无差异，但CD4+CD28-T细胞平均荧光强度更强。

图1 ITP患者PBMC中CD4+CD28-T细胞比例升高

图2 ITP中CD4+CD28-T细胞功能相关分子表达

2.3 ITP患者血浆中IL-18含量明显升高

根据蛋白芯片检测的OD值，利用R语言进行差异分析，结果发现（图3A），与HC相比，ITP患者外周血中29种蛋白含量明显下调，33种蛋白含量上升。IL-18广泛作用于T细胞，芯片结果亦提示ITP患者外周血IL-18 OD值较健康人水平高接近3倍，而IL-18BP无明显差异（图3B）。进一步利用ELISA验证ITP患者血浆中IL-18及IL-18BP水平，结果显示与HC相比，ITP患者血浆中IL-18水平明显升高[（354.90±27.84) pg/ml vs (274.50±21.49) pg/ml,P=0.026 0，图3C]，两组IL-18BP含量无明显差异[（366.40±17.03) ng/ml vs (339.90±13.45) ng/ml,P=0.226 0，图3D]。

图3 ITP患者血浆中IL-18含量明显升高

图4 IL-18提高ITP患者外周血CD4+CD28-T细胞比例

2.4 IL-18提高ITP患者外周血CD4+CD28-T细胞比例

体外IL-18处理ITP患者PBMC,3 d后流式检测提示CD4+CD28-T细胞比例明显升高[（33.140±3.688)%vs (26.170±2.637)%,P=0.036 1，图4]。

3、讨论

ITP是一种自身免疫介导的出血性疾病，定义为无明确诱因下出现孤立的外周血血小板计数减少，从而导致皮肤黏膜出血，严重者可出现重要器官出血而危及生命[10]。ITP发病机制复杂，既往认为ITP是B淋巴细胞介导的疾病，但近年研究发现T细胞异常亦是其主要致病因素[11-12]。CD4+CD28-T细胞是CD4+T细胞的特殊亚群，在健康年轻人中比例较低，但在老年人、自身免疫病、慢性感染性疾病中比例升高，尤其65岁以上人群可占CD4+T细胞的50%以上[13]。ITP中CD4+CD28-T细胞比例及功能如何的相关文献报道较少。本研究通过流式细胞术分析发现ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例较HC组明显升高，并进一步研究了其功能变化。

CD28是一种细胞表面糖蛋白受体，生理情况下作为T细胞活化所需的共刺激信号，对CD4+T细胞激活、增殖和存活至关重要。CD4+CD28-T细胞中虽然CD28在转录水平缺失，但在系统性红斑狼疮中证实此群细胞可优先分化为Th1表型，分泌IFN-γ和TNF-α[14]。ITP亦为Th1优势亚群疾病[15],Th1相关细胞因子IFN-γ和TNF-α在ITP中明显升高，故本实验进一步检测CD4+CD28-T细胞分泌促炎因子IFN-γ和TNF-α的能力，证实ITP中CD4+CD28-T细胞较HC IFN-γ和TNF-α分泌能力更强。一些自身免疫性疾病中证实CD4+CD28-T细胞释放穿孔素增加，导致其具有细胞毒性[16]。亦有研究表明ITP中CD3+T细胞及CD8+T细胞表达更多穿孔素基因，可能通过细胞溶解作用介导血小板破坏[17]。本实验检测了穿孔素分泌情况，CD4+CD28-T细胞较CD4+CD28+T细胞分泌穿孔素增多，推测CD4+CD28-T细胞可能通过其细胞毒作用参与血小板破坏。CD40L一过性表达于活化的T细胞表面，与B细胞表面的CD40结合，对B细胞扩增和分化起重要作用[18]。研究表明CD4+CD28-T细胞表面CD40L表达下降[13]，本研究亦证实与CD4+CD28+T细胞相比，CD4+CD28-T细胞表面CD40L呈低表达，对B细胞功能的影响需进一步探讨。

CD4+T淋巴细胞具有很强的异质性和可塑性，可在特异的病原学和特定环境因素下分化为不同细胞亚群[19-21]。为探讨ITP自身免疫的炎症环境下，哪些细胞因子影响CD4+T淋巴细胞功能，本实验首先通过蛋白芯片检测了5例ITP患者和5例性别、年龄相匹配的HC血浆中440种免疫细胞相关蛋白组分，筛查发现两组确实有多种蛋白含量存在差异。进一步查阅文献发现IL-18对CD4+T细胞作用广泛，几乎可调节各种T细胞亚群激活和分化，故进一步聚焦IL-18[6-7]。人体内存在IL-18天然拮抗剂IL-18BP，抑制IL-18的促炎作用，IL-18的作用取决于体内两者比例即未结合的IL-18[22]。故本实验进一步通过ELISA验证ITP血浆中IL-18和IL-18BP含量，结果提示ITP患者较HC血浆中IL-18含量升高，而IL-18BP含量无差异，提示ITP中确实存在较多未结合的IL-18。IL-18对CD4+CD28-T细胞作用如何？本研究利用IL-18体外刺激CD4+T细胞，发现刺激72 h后CD4+CD28-T细胞比例升高，提示IL-18可提高ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例。

综上，本研究发现ITP患者外周血中CD4+CD28-T细胞比例明显升高，且分泌促炎因子的能力较强，推测可能对ITP发病起促进作用。此外IL-18刺激可提高CD4+CD28-T细胞比例，IL-18或许可能为ITP的潜在治疗靶点。本实验初步探究了CD4+CD28-T的数量及部分功能特点，为进一步研究其作用机制及更广泛的功能提供了基础。

参考文献:

[9]侯明,胡豫.成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版)[J].中华血液学杂志,2020,(8):617-623.

基金资助:辽宁省自然科学基金面上项目(2021-MS-285);

文章来源:李伟平,白自然,田渝琴,等.免疫性血小板减少症患者外周血CD4+CD28-T细胞数量及功能分析[J].中国免疫学杂志,2024,40(12):2623-2627.