脓毒症相关性脑病(SAE)是由脓毒症引起的，没有中枢神经系统直接感染的急性弥漫性脑功能障碍[1]。老年人群由于机体抗感染免疫力降低，因此SAE发生率较高，预后较差[2]。SAE是一种神经系统无菌性炎症反应，传统反映炎症程度的指标[如白细胞计数(WBC)、降钙素原(PCT)]及反映脓毒症患者病情程度的指标[如急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)、序贯器官衰竭评分(SOFA)]均有助于评估SAE老年患者病情及病情程度。但临床中上述指标在SAE的诊断及预后评估中尚缺乏特异性，因此有必要寻找新的SAE血清标志物。长链非编码RNA核富含丰富的转录本1(lncNEAT1)参与形成核旁斑亚结构，与炎症、免疫、肿瘤及心血管疾病关系密切[3,4]。近年来有研究发现，在脂多糖刺激小胶质细胞后，活化的小胶质细胞lncNEAT1表达上调，其通过加重机体炎症反应及调节脂质代谢过程，参与SAE的发生发展[5]。可溶性髓样细胞触发受体-2(sTREM-2)是一种细胞膜表面蛋白分泌型形式，能与TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白形成受体信号复合物。sTREM-2可通过诱导炎症细胞因子如白细胞介素-1β等的产生，加重机体的炎症反应，与脓毒症、中枢神经系统感染等疾病关系密切[6,7]。本研究通过检测SAE老年患者血清lncNEAT1及sTREM-2的表达与SAE老年患者的临床预后的关系，现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年1月至2021年1月于本院诊治的224例脓毒症老年患者为研究对象，根据是否合并SAE分为SAE组(84例)和对照组(未并发脑损伤140例)。SAE组根据28 d内的生存情况分为存活组(44例)和死亡组(40例)。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

纳入标准：(1)年龄>60岁；(2)脓毒症诊断符合2016年美国重症医学会发布的脓毒症3.0诊断标准[8];(3)SAE诊断排除中枢神经系统原发疾病、药物及电解质紊乱等因素的影响，患者表现为谵妄、定向力障碍及意识障碍等精神状态急性改变；(4)患者及家属对本研究知情并签字。排除标准：(1)存在中枢神经系统感染、脑血管意外或颅内器质性病变等；(2)存在肝性脑病、肺性脑病及糖尿病酮症酸中毒等；(3)精神障碍性疾病；(4)合并恶性肿瘤。

1.2方法

采用静脉采血法抽取所有研究对象入院后清晨空腹肘静脉血5 mL至不含抗凝剂的采血管中，37℃静置1 h后凝固分层，3 000 r/min离心10 min分离血清，分装后保存于-80℃冰箱待测。采用荧光定量PCR(qPCR)检测血清lncNEAT1的表达。Trizol法提取血清总RNA,微量分光光度计测定血清总RNA纯度。将血清总RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行qPCR反应。反应体系共10μL:cDNA 0.2μL,2×SYBR Green Premix 5μL,上游和下游引物各1μL,去离子水3.8μL。反应程序：95℃ 预变性5 min, 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 70℃延伸30 s,共40个循环。引物：lncNEAT1的正向序列为5′-CTC AGA CCA CAA CTC TCC ACC TTG-3′,反向序列为5′-CAG ATG CTG CCT GGC TGA TGG-3′;GAPDH正向序列为5′-GTG AAG GTC GGA GTC AAC-3′,反向序列为5′-GTT GAG GTC AAT GAA GGG-3′。2-ΔΔCt法对lncNEAT1的相对表达量进行分析，ΔCt=CtlncNEAT1-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清sTREM-2水平。人sTREM-2 ELISA试剂盒购自上海瑞番生物科技公司。人神经元特异性烯醇化酶(NSE)ELISA试剂盒购自上海沪震生物公司。实验步骤按照严格按照试剂盒说明书进行。Microlab FAME全自动酶标仪购自瑞士哈美顿公司。

收集所有研究对象的年龄、性别、体质量指数、受教育年限、高血压史、糖尿病史、感染部位等一般临床资料。收集入院后48 h以内的实验室常规检查资料，NSE采用ELISA检测，中枢神经特异性蛋白(S100β)采用免疫层析法检测，PCT采用罗氏Combas e601电化学发光全自动免疫分析仪器及配套试剂检测。收集并统计患者入院48 h内APACHEⅡ评分、SOFA评分和28 d内患者生存情况。

1.3统计学处理

采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。计量资料经正态性检验符合正态分布时以x¯±s

表示，组间比较采用t检验。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。多因素分析采用Logistic回归分析。受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncNEAT1、sTREM2、NSE、S100β表达及联合检测对SAE老年患者生存预后的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1SAE组和对照组血清lncNEAT1、sTREM2表达比较

SAE组血清PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ评分、SOFA评分、lncNEAT1、sTREM2表达明显高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.001)。SAE组和对照组患者在性别、年龄、体质量指数、受教育年限、高血压史、糖尿病史及感染部位方面比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.2不同预后SAE老年患者临床指标比较

与生存组相比，死亡组SAE老年患者PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ评分、SOFA评分、lncNEAT1及sTREM2表达明显较高，差异有统计学意义(均P<0.05)。两组在性别、年龄、体质量指数、受教育年限、高血压史、糖尿病史、感染部位及WBC方面比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表1 SAE组和对照组血清lncNEAT1、sTREM2表达比较

表2影响SAE老年患者28 d生存预后的因素

2.3血清lncNEAT1、sTREM2表达与SAE老年患者临床参数的相关性

Pearson相关性分析结果显示，SAE老年患者血清lncNEAT1表达与PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关(r=0.451、0.503、0.514、0.609、0.674,均P<0.001);SAE老年患者血清sTREM2表达与PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关(r=0.451、0.503、0.514、0.709、0.617,均P<0.001)。

2.4多因素Logistic回归分析影响SAE老年患者生存预后的因素

以SAE老年患者是否发生死亡为因变量(赋值：1=死亡，0=生存),以lncNEAT1、sTREM-2为自变量，以PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ评分、SOFA评分为协变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，同时校正PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ评分、SOFA评分后，血清lncNEAT1、sTREM-2表达升高是影响SAE老年患者不良生存预后的独立危险因素。见表3。

2.5血清lncNEAT1、sTREM2及联合检查对SAE老年患者生存预后的评估价值

当ROC曲线中约登指数最大时，血清lncNEAT1、sTREM2的最佳截断值分别为6.52、34.71 pg/mL。血清lncNEAT1、sTREM2联合检查对SAE老年患者生存预后评估的曲线下面积(AUC)为0.874,显著高于血清lncNEAT1、sTREM2单一指标检测，AUC为0.797、0.820,差异有统计学意义(Z=4.864、3.872,P<0.001、P=0.003)。见表4。

表3影响SAE老年患者生存预后的多因素Logistic回归分析

表4血清lncNEAT1、sTREM2及联合检测对SAE老年患者生存预后的评估价值

3、讨 论

SAE是脓毒症严重并发症之一，是由脓毒症全身炎症反应引起的急性弥漫性脑功能障碍，表现为轻度谵妄到昏迷等。有研究报道，合并SAE的脓毒症患者病死率显著升高，并且SAE病情严重程度与患者病死率呈正相关[9]。本研究中，脓毒症患者SAE发病率为37.5%(84/220),28 d病死率为47.62%(40/84),均与既往报道的SAE发病率和病死率的结果相近[1]。因此，早期诊断和治疗SAE,对于降低患者病死率至关重要。SAE的临床诊断为排除性诊断，目前尚无明确的诊断标准及实验室检查指标。血清PCT等炎症指标是评估脓毒症严重程度的指标，但临床中PCT难以有效评估SAE老年患者的预后情况。SAE的发病涉及多种机制。SAE患者脑微循环改变和血脑屏障破坏导致大量炎症因子及内毒素入脑，引起脑部无菌性炎症，导致SAE的发生。此外，大量假性神经递质形成及线粒体功能障碍等因素也会导致SAE的发生。近年来报道较多的是中枢神经系统损伤的生物标志物如NSE及S100β等，有助于SAE的早期诊断，但这些指标的灵敏度及特异度不高，临床应用价值有限[10]。深入研究SAE的发病机制，寻找能够评估SAE预后的血清标志物，对于早期临床干预，降低SAE病死率具有重要意义。

lncRNA是长度为200～300个核苷酸RNA调控分子，广泛参与个体生长发育、炎症、感染及免疫等病理生理学过程[11]。lncNEAT1是近年来发现的新的lncRNA,表达于人类心肌细胞、肾小管上皮细胞中，参与人类炎症、组织损伤和多器官功能衰竭等疾病的发生发展[3,4]。近年来有研究报道，血清lncNEAT1表达升高能够增加脓毒症患者急性呼吸窘迫综合征发生的风险，与患者疾病严重程度呈正相关[12]。本研究中，SAE组患者血清lncNEAT1表达明显升高，分析其原因可能是，脓毒症时细菌脂多糖能够刺激机体单核细胞，导致lncNEAT1表达升高，lncNEAT1能够作为分子海绵，结合并抑制微小RNA-124的表达，导致其下游分子靶点如肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β等表达升高，加重机体的炎症反应程度[13]。本研究中，SAE老年患者血清lncNEAT1表达与血清PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关，提示血清lncNEAT1表达与SA患者疾病严重程度有关。其原因一方面是lncNEAT1能够通过上调白细胞介素-6,白细胞介素-17等炎症因子的表达，加重机体炎症反应程度，导致大量炎症因子通过受损的血脑屏障，引起大脑功能障碍，导致SAE的发生[13];另一方面是lncNEAT1能够通过直接诱导中枢神经细胞的损伤，促进SAE的疾病进展。有学者发现，脓毒症小鼠脑组织中lncNEAT1表达升高通过促进核因子κB的表达，促进脓毒症小鼠神经细胞的凋亡，加重脑组织损伤，而敲低lncNEAT1表达可明显减轻脓毒症小鼠神经细胞凋亡[14]。本研究中，血清lncNEAT1表达与SAE老年患者28 d生存预后有关，是影响SAE老年患者生存预后的独立危险因素，表明检测SAE老年患者血清lncNEAT1表达有助于评估临床预后，可能是新的SAE老年患者生存预后的血清标志物。其机制可能与lncNEAT1参与加重脓毒症炎症反应有关。有学者发现，在脂多糖诱导的RAW264.7细胞中lncNEAT1表达升高，其能够与POU结构域2类转录因子1 mRNA的3′UTR区结合，促进脂多糖诱导的RAW264.7细胞的炎症反应，加重脓毒症的疾病进展[15]。尚有学者发现，脓毒症感染小鼠的神经细胞中lncNEAT1表达增加，其能够与血红蛋白亚单位β相互作用并抑制其降解，进而抑制突触后密度蛋白95水平，降低神经元树突棘密度，导致实验动物脓毒症后的焦虑样行为和认知障碍[16]。

sTREM-2主要表达于小胶质细胞中，参与调节小胶质细胞吞噬功能，与人类阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和艾滋病相关神经认知障碍等疾病密切相关[17]。近年来有研究发现，外周血sTREM2的表达升高能够加重神经系统疾病患者认知功能障碍，可作为神经系统疾病预后评估的血清标志物[18]。本研究中，SAE老年患者血清sTREM-2表达明显升高，其表达升高的机制与SAE老年患者小胶质细胞过度激活有关。有研究表明，SAE老年患者神经系统炎症反应能够激活小胶质细胞，导致SAE老年患者血清和脑脊液中sTREM-2和神经丝轻链蛋白水平显著升高，sTREM2表达升高可通过促进神经突触中淀粉样蛋白沉积，加速神经突触传导功能丧失，促进患者认知功能障碍，导致SAE的发生[7]。本研究中，SAE老年患者血清sTREM-2的表达与血清PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ评分、SOFA评分呈正相关，提示血清sTREM-2表达升高促进SAE疾病进展。其原因可能是sTREM的表达升高加重脓毒症患者神经系统炎症反应。有研究报道，sTREM2的表达上调能够磷酸化激活磷脂酰肌醇3激酶/Akt信号通路，促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素-6的表达，加重神经炎症并促进神经细胞凋亡，导致神经系统损伤[19]。此外，sTREM-2是小胶质细胞过度激活的重要标志物，小胶质细胞的过度活化能够分泌产生大量促炎细胞因子，如白细胞介素-6等，加重神经系统炎症反应及脑组织损伤。本研究中，SAE老年患者血清sTREM2表达与28 d生存预后有关，是影响患者生存预后的独立危险因素，提示检测血清sTREM2水平有助于评估SAE老年患者的临床预后，这与sTREM-2对机体抗感染免疫抑制作用有关。有研究发现，革兰阴性病原体感染的动物模型中，sTREM-2的表达升高能够抑制机体骨髓源性巨噬细胞对病原体的吞噬和杀伤作用，从而加重机体的炎症反应，加重器官损伤和增加实验动物的病死率[20]。

本研究中，APACHEⅡ评分及SOFA评分不能作为影响SAE不良预后的独立因素，其原因可能是APACHEⅡ评分和SOFA评分所涉及的评分项目涵盖患者的健康状况、年龄等因素，导致研究过程中的混杂因素较多，难以准确评估SAE老年患者的临床预后。本研究利用ROC曲线分析发现，血清lncNEAT1、sTREM2、NSE、S100β联合检测对SAE老年患者生存预后具有较高的评估价值，临床医生可根据血清lncNEAT1、sTREM2水平对SAE老年患者的临床预后进行评估，对于高危患者予以早期诊治及预防，提高患者的生存率。

综上所述，SAE老年患者血清lncNEAT1,sTREM2表达升高，两者表达与SAE疾病严重程度有关，共同参与SAE疾病的发生发展。血清lncNEAT1、sTREM2表达升高是影响SAE老年患者28 d生存预后的独立因素。但本研究也存在一定的不足，由于本研究样本量有限，可能存在一定的研究偏倚，有待今后前瞻性、多中心、大样本的临床研究进一步证实本研究的结论。

参考文献:

[10]赵孝开,李晓亮,肖宏涛,等.血清NSE､S100β､IL-6与烧伤患者脓毒症相关性脑病的相关性分析[J].中国烧伤创疡杂志,2020,32(6):406-408.

基金资助:海南省卫生健康行业科研项目(20A200326);

文章来源:王桂瑜,欧阳葵,苏小田等.血清lncNEAT1和sTREM-2在SAE老年患者中的表达及临床意义[J].国际检验医学杂志,2023,44(22):2751-2756.