粒细胞集落刺激因子(G-CSF,又称CSF3)是一种重要的体内细胞因子，于1966年由Metcalf团队首次发现并从小鼠内毒素血清中成功分离，因其在半固体培养基中形成微菌落的能力而命名[1]。研究表明，CSF3能够诱导粒细胞的增殖分化，并在免疫、炎症和肿瘤等疾病中发挥重要作用[2,3,4]。粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞，对先天免疫及炎症至关重要，能够被迅速募集到感染部位，识别、吞噬和消除微生物[5,6]。由于CSF3能催化骨髓中性粒细胞成熟和动员，而CSF3蛋白的改良形式通常用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症[7],因此CSF3一直是免疫相关炎症主要研究的对象。

CSF3在体内可由多种免疫细胞产生，主要通过二聚形式与其CSF3受体(G-CSFR)以2∶2比例结合，触发下游信号通路，从而发挥抑制细胞凋亡、促进中性粒细胞成熟与分化、诱导中性粒细胞迁移和IL-8产生的作用[2,8]。作为免疫关键因子，其作用是双面的，既可促炎也可抗炎。这些特性与CSF3能促进粒细胞增多和先天炎症反应有关，但炎症和中性粒细胞激活通路上调会抑制适应性免疫相关基因的表达，如抗原呈递、共刺激、T细胞活化和溶细胞效应反应，即CSF3具有抑制适应性免疫的作用[9]。同时CSF3能下调INF-γ的产生，高剂量CSF3能上调激活T细胞和白细胞介素-4(IL-4)的产生。因此，CSF3提供先天免疫刺激信号有助于防止过度和潜在恶化炎症反应的发展及免疫记忆形成[10]。在病原体感染中，CSF3同样发挥双面作用：小鼠感染流感病毒后，由于G-CSF产生不足以及流感病毒引起的中性粒细胞功能障碍，从而导致继发性细菌感染[11]。在新冠病毒研究中，通过组学分析认为CSF3是潜在的药物靶点[12]。CSF3可能在血液和免疫系统、肿瘤、神经系统等众多领域具有研究和应用价值，然而CSF3与病原菌感染的直接互作证据，及其在感染炎症性疾病中的调控机制尚不明确。

本研究采用生物信息学方法对人CSF3蛋白进行分析，因其在不同物种之间的高同源性，可通过动物实验研究CSF3的其它未知功能。构建CSF3 pGLO1质粒在原核系统中表达CSF3蛋白，并进行镍离子亲和层析纯化和Superdex200Increase 10/300 GL凝胶过滤层析纯化，以期获得高纯度的重组人CSF3蛋白。构建融合pmCherry荧光标签的CSF3重组质粒，通过转染HEK-293T细胞以确定CSF3融合cherry蛋白的亚细胞定位，为重组CSF3药物的研发以及揭示其在病原菌感染、免疫中的调控机制研究奠定基础。

1、材料与方法

1材料

1.1质粒和细胞

pGLO1 CSF3质粒引物由生工生物公司制备，其中表达载体pGLO1由pET-15b改造而来，具有氨苄抗性，N端6个His标签含PPase酶切位点。荧光质粒CSF3 pmCherry引物由生工生物公司合成。HEK-293T细胞由实验室传代保存。

1.2主要试剂和仪器

T4连接酶，限制性内切酶XhoΙ和BamHΙ购于美国Thermo公司；2×MultiF Seamless Assembly Mix酶和DpnI酶购于中国ABclonal公司；氨苄青霉素钠，硫酸卡那霉素及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均购于美国索莱宝公司；镍离子亲和层析柱基质及AKTA纯化机器购于美国GE公司；Superdex200Increase 10/300 GL凝胶过滤层析柱购于思拓凡(Cytiva)生物科技有限公司；pmCherry-N1空载质粒购于科研云生物公司；DMEM培养基购于美国Gibco公司；jetPEI试剂购于法国Polyplus生物技术公司；荧光共聚焦显微镜为德国蔡司公司生产。

2方法

2.1人CSF3蛋白的生物信息学分析

在Uniprot数据库中获得人CSF3蛋白序列及分子质量，利用在线网站(https: //web.expasy.org/protparam/)以及Software Suite for Sequence Analysis在线软件对其二级结构及理化性质进行分析，将人CSF3与其同源序列进行保守结构域比对，结合PDB数据库下载的人CSF3蛋白预测结构，用PymoL软件分析预测人CSF3蛋白的理化性质。

2.2人CSF3蛋白原核表达系统的构建和鉴定

由于CSF3剪接体-1只比剪接体-2多3个氨基酸，通过NCBI数据库下载人种属来源的目的基因的碱基序列以实验室保存的CSF3 pGLO1剪接体-1为模板，使用QuikChange方法设计实验引物(表1),引物由生工生物公司合成，经PCR获得CFS3 pGLO1剪接体-2线性质粒，加入DpnI酶切后转化入大肠杆菌感受态细胞BL21,37℃培养1 h。取菌液涂于带有氨苄抗性的固体培养基平板上，置于37℃恒温箱培养过夜。挑取平板上的单菌落用含氨苄抗性的LB培养基培养3～4 h,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导蛋白，进行蛋白表达检测。采用SDS-PAGE电泳鉴定阳性克隆菌株送测序。

2.3人CSF3蛋白的大量表达与纯化

取重组菌过夜培养，次日接种于1L含氨苄抗性的LB培养基中，37℃、200 r/min培养至A600值为0.8时降温至16℃,继续培养1h,加入IPTG诱导培养过夜。收集全菌液离心，收集菌体沉淀，超声破碎后离心，分别取上清和沉淀，流穿亲和镍柱后用PP酶酶切过夜，得到纯化的目的蛋白。取纯化蛋白用Superdex200Increase 10/300 GL凝胶过滤层析柱作进一步纯化，根据峰值位置收集对应收集管中的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，制备的高纯度蛋白分装后经液氮速冻后存于-80℃冰箱。

表1 PCR引物设计

2.4 CSF3基因融合荧光质粒的构建和鉴定

使用SnapGene软件以及pmCherry-N1图谱设计PCR引物(表1),引物由生工生物公司合成。以CSF3 pGLO1为模板进行PCR扩增，将PCR产物与带有卡那抗性的pmCherry -N1质粒用XhoΙ和BamHΙ同步进行双酶切，然后进行连接，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中过夜，第2 d挑单克隆菌落接种于含卡那抗性的LB培养基中培养5～6 h后送生工生物公司测序。

2.5 CSF3基因的亚细胞定位

将测序正确的重组菌用200 mL带有卡那抗性的LB培养基培养过夜，用Endo-Free Plasmid Maxi Kit试剂盒大量抽提质粒。在六孔板中培养HEK-293T细胞，两次传代至状态良好。将jetPEI试剂和质粒分别用100 mmol/L NaCl稀释，混合后孵育15～30 min,然后添加到HEK-293T细胞中转染48 h,用4%多聚甲醛固定10～20 min,用PBS洗涤两次。用DAPI染色5～8 min, PBS洗涤3～5次，通过荧光显微镜观察确定CSF3在细胞中的亚定位，并记录观察结果。

2、结 果

1人CSF3蛋白的生物信息学分析

1.1人CSF3理化性质

人CSF3蛋白是一种糖蛋白，查阅Uniprot数据库得知人CSF3蛋白共有三种剪接体，其中发挥功能最多最常见的是剪接体-2(本文研究以剪接体-2为主，全文中CSF3指剪接体-2),全长有204个氨基酸，相对分子质量22×103,其中第1-30位氨基酸是信号肽，信号肽部分被切割从而形成31-204位氨基酸构成的多肽，相对分子质量18.8×103[13]。CSF3第163位氨基酸为糖基化修饰位点，全长包含5个半胱氨酸，构成两个二硫键，等电点为5.81,属于IL-6超家族(图1)。人CSF3的不稳定系数为60.95,为不稳定蛋白。通过 网址对其亲疏水性进行预测，为亲水蛋白(图2)。

图1人CSF3蛋白保守结构域分析  

图2人CSF3蛋白亲水性预测  

1.2 CSF3同源序列比对及保守结构域分析

人类CSF3编码基因位于第17号染色体的q21-22区，由Uniprot数据库中已通过实验测定并提交到蛋白质结构数据库的信息，以及CSF3全长蛋白的预测结构可看出，CSF3的三级结构由信号肽α螺旋，4个反平行的α螺旋，β平片和不规则卷曲组成(图3)。CSF3的同源蛋白234个，在真核生物、细菌、古菌、病毒中广泛存在。将人源CSF3的3种剪接体与其他物种CSF3蛋白的同源序列进行比对，整体同源性为78.64%。在比对的序列中使用一种保守性色阶标示不同保守程度的氨基酸残基，结果如图4。其中紫色表示该区域氨基酸与同源氨基酸序列100%保守，深红色表示保守性>75%,粉红色代表保守性>50%。表明CSF3的主链结构域在不同物种中具有高度的保守性。

图3人CSF3 fl蛋白三级结构预测  下

图4 CSF3同源氨基酸序列比对 

2人CSF3蛋白的原核表达与鉴定

对QuikChange PCR扩增的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，其大小约为5 kb(图5)。通过转化后抗性筛选，获得阳性克隆菌株。选取单克隆菌株进行培养，经过IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析，表达蛋白分子质量约为20.8×103(图6)。选取1号和2号菌株进行测序，经比对验证测序结果正确。

图5 QuikChangePCR产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定  

图6单克隆菌株表达人CSF3蛋白的SDS-PAGE电泳分析  

3人CSF3蛋白的纯化

将重组菌过夜培养后进行低温诱导表达，通过镍柱亲和层析获得纯度较高的目的蛋白，结果如图7。其中R为酶切后的目的蛋白，预测该蛋白性质较为不稳定，对热以及酸碱较为敏感，且容易聚集。用Superdex200Increase 10/300 GL凝胶过滤层析柱进行纯化，取收集的第4～12管样品进行SDS-PAGE电泳，结果如图8和图9。表明蛋白CSF3切掉标签后性质更为稳定，凝胶过滤层析纯化峰值单一，蛋白纯度较好。

图7镍离子层析纯化人CSF3蛋白SDS-PAGE分析  

M蛋白分子质量标准Ce IPTG诱导重组菌超声破碎全蛋白悬液S IPTG诱导重组菌超声破碎上清fl IPTG诱导重组菌超声破碎上清镍离子亲和层析柱流穿液R无组氨酸标签蛋白洗脱液e镍离子亲和层析柱总蛋白洗脱液

图8切标签人CSF3蛋白凝胶过滤纯化 

4 CSF3基因融合荧光质粒的构建及鉴定

以CSF3 pGLO1质粒(剪接体-2)为模板对目的基因片段进行扩增，结果如图10。扩增产物与实验室保存的pmCherry-N1载体质粒进行双酶切，获得预期大小为522 bp的目的基因片段和载体片段(图11)。将目的片段与载体片段连接后获得质粒送测序，结果证明构建的融合荧光标签质粒正确且完整。

图9凝胶过滤纯化的切标签人CSF3蛋白SDS-PAGE电泳分析  

图10 CSF3基因PCR结果 

图11 CSF3以及pmCherry-N1质粒双酶切结果  

5 CSF3基因在细胞中的定位

将构建的融合Cherry标签的CSF3分泌肽段的质粒转染到HEK-293T细胞中，48 h后用共聚焦显微镜观察细胞定位情况，结果如图12。细胞质中出现红色荧光，显示融合pmCherry标签的CSF3蛋白在细胞质中呈弥散性分布，且红色荧光在HEK-293T细胞中存在局部聚集，提示融合pmCherry标签的CSF3蛋白定位在细胞质中，并呈现特定的定位和分布模式。

图12 pmCherry荧光标签融合人CSF3在HEK-293T中的亚细胞定位  

3、讨 论

CSF3在临床上被广泛用于预防细胞毒性化疗后的中性粒细胞减少，并动员造血干细胞用于移植[14]。CSF3受体在粒细胞形成的所有阶段高表达，表明CSF3功能具有广泛多效性。因此，CSF3介导的中性粒细胞的增殖分化在感染、免疫和肿瘤中扮演重要角色[15,16]。通过小鼠模型发现，在感染过程中，CSF3表达量增加促进感染的清除和维持小鼠的存活，因此有助于宿主的防御[17]。然而大量证据表明CSF3在自身免疫性疾病、炎症性肺病以及缺血再灌注损伤中可能加剧炎症性疾病的发展，因此CSF3在感染免疫中的作用呈现复杂性[2]。研究发现CSF3在多种肿瘤中高表达，主要通过信号转换器和转录激活因子3(STAT3)信号通路促进髓系抑制细胞(MDSCs)的存活和激活，因此成为肠道相关癌症的潜在治疗靶点[18]。在动物模型中，G-CSF可激活来自小鼠和人类供体的中性粒细胞和造血干细胞的自噬，因此CSF3在造血和髓系细胞的自噬中发挥重要作用[14]。这些研究结果进一步强调了CSF3在不同生理和病理情况下的多重调节作用，为理解其生物学功能提供了线索。

迄今为止，关于人细胞因子CSF3与病原菌中蛋白的直接互作的报道尚少。虽已成功解析了CSF3及其受体复合物的结构，然而同人与小鼠GCSF-R的细胞因子受体同源结构域相比，该复合物的构象存在显著差异。值得注意的是，该构象与IL-6/gp130信号复合物的结构相似[19,20]。为了揭示CSF3与病原菌蛋白之间的相互作用关系，有必要进一步开展相关研究，从而为生物医学和免疫学领域提供更加全面和准确的科学支持。Miyafusa等[21]通过设计末端环化的CSF3变体，并运用分裂蛋白技术，在最小插入的情况下形成肽键，耐热性和化学变性分析结果表明环状CSF3变体相较于线性CSF3表现出更高的热稳定性和聚集抗性，这一特性提升了环状CSF3变体的免疫原性，对于改进生物医学及其他应用中循环蛋白的设计具有积极意义，该研究成果还为G-CSF生物改善剂的发展提供了参考[22,23]。这些发现不仅有助于揭示CSF3与病原菌蛋白之间的相互作用机制，同时在探索免疫调节、感染防御和疾病治疗等领域具也具有潜在意义。

本研究采用系统化的生物信息学方法对人CSF3蛋白进行了全面分析，并构建了CSF3 pGLO1质粒，实现了在原核表达系统中对其进行高效表达。由于该蛋白在不同物种中存在高度同源性，因此可成为未知功能动物实验研究的工具。用构建的融合pmCherry荧光标签CSF3重组质粒转染HEK-293T细胞，初步揭示CSF3融合cherry的蛋白主要定位在HEK-293T细胞质中并有局部聚集现象，为重组CSF3药物的开发及其在病原菌感染和免疫调控中的作用机制研究奠定了基础。

文章来源:张平,李贺,刘晓宇等.人CSF3蛋白的原核表达和纯化及其亚细胞定位[J].中国病原生物学杂志,2024,19(03):285-290+296.