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衰老对小鼠角膜中Pax6和Wnt7a表达的影响

2024-09-12 68 上传者：管理员

摘要：目的研究衰老对小鼠角膜中配对盒基因(Pax)6和Wnt7a表达的影响，探索其与角膜缘干细胞(LSCs)衰老的关系。方法 60只雌性昆明小鼠分为3组：青年组(2月龄),中年组(10月龄),老年组(18月龄)各20只。苏木素-伊红(HE)染色观察角膜形态结构改变，免疫荧光染色和流式细胞术检测p63、Pax6和Wnt7a分布和表达，实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测p63、Pax6和Wnt7a mRNA相对表达。结果与青年组相比，随着月龄的增加，小鼠角膜上皮的厚度明显变薄，角膜厚度明显增厚，p63、Pax6和Wnt7a表达均逐渐明显减少(P<0.05)。结论随着增龄，角膜呈老化趋势，可能与Pax6-Wnt7a调控有关。

关键词：
p63
Wnt7a
衰老
角膜缘干细胞
配对盒基因(Pax6)
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角膜缘干细胞(LSCs)[1,2]位于角膜缘基底层内，其增殖、分化不断补充角膜上皮。而角膜上皮的更新和脱落能够维持角膜的通透性，维持其正常的生理功能。随着年龄的增加，角膜组织的更新和修复能力逐渐减弱，这可能与LSCs衰老有关[3]。配对盒基因(Pax)6在眼的发育过程中起着非常重要的作用[4]。Pax6基因不仅与虹膜发育有关，同时与角膜及神经视网膜的形成也密切相关[5]。Pax6基因参与细胞增殖和衰老调控，抑制Pax6基因能降低细胞的增殖能力，Pax6过表达能够促进细胞增殖从而延缓细胞衰老[6,7]。Wnt信号通路广泛存在于多种生物体内，在细胞衰老及衰老相关疾病中发挥重要作用[8]。Wnt7a和Pax6在角膜谱系专向分化中起重要作用，Wnt7a和Pax6是调控LSCs分化的关键因子[9,10]。本研究以不同月龄的小鼠为研究对象，通过形态技术、流式细胞技术及实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)技术观察p63、Pax6和Wnt7a在角膜中定位和表达，探究其与LSCs衰老的关系。

1、材料与方法

1.1材料

甲醛-乙醇-冰醋酸(AFA)固定液配制：20%甲醛40 ml+95%乙醇60 ml+冰醋酸5 ml(现配现用)。兔抗p63多克隆抗体(稀释浓度1∶200)、兔抗Pax6多克隆抗体(稀释浓度1∶200)、兔抗Wnt7a单克隆抗体(稀释浓度1∶300)、别藻蓝蛋白(APC)山羊抗兔荧光二抗(稀释浓度1∶500)购自Abcam; Cy3荧光山羊抗兔二抗(稀释浓度1∶300)购自碧云天公司。TaKaRa(RR820A)试剂盒购自TaKaRa公司。p63、Pax6、Wnt7a和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2动物分组和取材

健康SPF级昆明雌性小鼠，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(黔)2018-001。按月龄分为3个组：青年组(2月龄)、中年组(10月龄)、老年组(18月龄),每组动物数20只。饲养至时间节点，2%戊巴比妥麻醉处死小鼠，取眼球行相关检测。

1.3苏木素-伊红(HE)染色

摘取右侧眼球，投入AFA固定液中固定，每间隔6 h换新的AFA固定液固定，针刺眼球后壁开窗，共固定18 h。常规乙醇梯度脱水、氯仿透明、石蜡包埋制作眼球切片，厚度6μm,行HE染色，上行-二甲苯透明，中性树胶封片后正置荧光显微镜下观察并采集图片。

1.4免疫荧光染色

将眼球组织切片常规化蜡后，用柠檬酸蒸煮10 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。加入山羊血清工作液封闭45 min。去掉山羊血清，不洗，分别直接加入一抗(p63、Pax6或Wnt7a)4℃过夜。隔天取出，去除一抗，PBS洗涤3次，加入Cy3荧光二抗37℃水浴2 h。去除二抗，PBS洗涤3次，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核15 min, PBS洗涤3次，荧光淬灭剂封片后正置荧光显微镜下观察并采集图片。采用Image-Pro plus软件计算各组角膜中p63、Pax6、Wnt7a表达量。

1.5流式细胞术检测

取小鼠的右侧眼球，小心除去周围的结缔组织，从角膜与巩膜交界的地方分离角膜组织。用眼科剪尽可能地剪碎角膜组织，加入4%甲醛固定45 min,加入2%牛血清蛋白(BSA)重悬组织细胞，调整组织细胞量约106个/管，加入一抗(p63、Pax6或Wnt7a),混匀冰上孵育45 min, PBS洗2遍，去掉一抗，2%BSA 100μl重悬后，加入APC荧光二抗避光冰上孵育30 min,去除二抗，PBS重悬，混匀后上机检测。

1.6 RT-qPCR检测p63、Pax6和Wnt7a mRNA表达

取小鼠的左侧眼球，采用Trizol法提取每组小鼠角膜组织内总RNA,使用逆转录试剂盒利用随机引物法合成cDNA第一链，按照TaKaRa试剂盒说明书，在StepOnePlus PCR仪中进行扩增，扩增条件为95℃变性1 min, 95℃5 s, 60℃30 s, 68℃30 s,共计40个循环，检测各组角膜内p63、Pax6和Wnt7a mRNA相对表达。最后根据公式2-ΔΔCt计算目标基因相对表达量。

1.7统计学分析

采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验。

2、结果

2.1各组角膜组织的形态学变化

石蜡组织HE染色显示不同月龄小鼠角膜组织结构：依次为角膜上皮、前界膜、角膜基质、后界膜和角膜内皮；角膜上皮为未角化的复层扁平上皮，层数较多，有5～7层，基底层细胞呈矮柱状或立方形，胞体较小，细胞核大而圆。与青年组相比，随着月龄的增加，小鼠角膜上皮厚度逐渐明显变薄，整体角膜厚度逐渐明显增厚(P<0.05)。见表1、图1。

2.2各组角膜中p63、Pax6和Wnt7a阳性细胞比例

与青年组相比，随着月龄增加，p63、Pax6和Wnt7a阳性细胞比例逐渐明显减少(P<0.05)。见表1、图2。

2.3各组角膜组织中p63、Pax6和Wnt7a表达

免疫荧光结果显示，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)显示细胞核，蓝色荧光；Cy3红色荧光分别标记p63、Pax6和Wnt7a。p63阳性反应，红色荧光，主要表达于角膜基底层细胞核上；Pax6阳性反应，红色荧光，主要表达于角膜上皮全层细胞核上；Wnt7a阳性反应，红色荧光，主要表达于角膜上皮全层的细胞膜上。见图3、图4。与青年组相比，随着月龄增加，p63、Pax6和Wnt7a表达量逐渐明显减少(P<0.05)。见表1。

与青年组相比：1)P<0.05;与中年组相比：2)P<0.05;下表同

表1各组角膜上皮和角膜厚度、p63、Pax6与Wnt7a阳性细胞比例、p63、Pax6与Wnt7a表达比较

图1各组角膜形态(HE染色，×400)

图2各组角膜中p63、Pax6和Wnt7a阳性细胞比例

图3各组角膜中p63、Pax6表达(免疫荧光，×400)

图4各组角膜中Wnt7a表达(免疫荧光染色，×400)

2.4各组角膜中p63、Pax6和Wnt7a mRNA表达

与青年组相比，随着月龄的增加，p63、Pax6和Wnt7a mRNA相对表达量逐渐明显减少(P<0.05)。见表2。

表2各组角膜中p63、Pax6与Wnt7a mRNA相对表达比较

3、讨论

组织器官的衰老与干细胞的衰老密切相关[11]。角膜上皮为未角化复层扁平上皮，基底层细胞为柱状，具有一定的增殖能力，能够分化和迁移维持角膜上皮的稳定性。角膜基质是由大量平行的胶原纤维排列而成。胶原纤维排列紧密能够减少光的散射，维持正常视力。本研究结果提示，角膜上皮的细胞数量随着小鼠月龄的增加逐渐减少，而角膜基质活性代偿性增强，大量胶原纤维开始合成，使角膜基质层增厚。临床研究表明[12],老年人角膜受损后角膜形态及功能的恢复和青年人相比较为缓慢和困难，也为上述观点提供了有力证据。

细胞衰老和凋亡增加引起LSCs的细胞功能下降、细胞数量减少，从而导致LSCs缺乏(LSCD)[13]。转录因子p63是p53家族成员之一，可特异性在人的角膜缘基底部表达，可用作LSCs干性标志物[14,15]。一些具有增生能力的干细胞可表达p63,p63高表达的细胞具有向复层上皮分化的潜能[16～18]。本研究结果也间接反映了LSCs的增生潜力也随年龄增长有不断降低的趋势，这或许是老年患者角膜上皮受损后愈合缓慢的原因之一。

生物体的衰老实际上是干细胞的衰老，同时体内外多种信号刺激调节干细胞的衰老。Wnt信号转导途径是调控细胞生长、发育和分化的关键途径之一[19]。Wnt7a是Wnt家族中的一员，可通过多种途径作用于下游靶分子而发挥生物学效应[20,21]。Pax6对维持角膜上皮正常分化有重要作用，Wnt信号通路调控Pax6的表达对维持LSCs特性有重要意义[14,22]。角膜缘“龛”环境异常，Wnt7a-Pax6轴受到抑制[23],致使LSCs不能正常分化，逐渐被耗竭导致LSCD发生[24]。本研究结果提示，LSCs衰老的更新调节与Pax6和Wnt7a这两个基因表达密切相关，具体调控机制有待进一步明确。综上，随着增龄，角膜呈老化趋势，可能与Pax6-Wnt7a轴调控有关。

参考文献:

2杨怡田,李梅,郭银霞,等.自体角膜缘干细胞移植术联合丝裂霉素C治疗翼状胬肉的疗效观察[J].局解手术学杂志,2019;28(5):75-8.

4李志清,黄悦,孙慧敏.PAX6基因在眼发育中的调控作用[J].国际眼科杂志,2013;13(4):685-7.

7王惠,王飞,楚瑞雪,等.抑制Pax6基因表达对视网膜母细胞瘤增殖侵袭的影响及其作用机制[J].实用癌症杂志,2020;35(12):1961-4.

8樊廷俊,郑明月,徐彬.Wnt信号通路调控衰老相关疾病的研究进展[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2020;50(11):62-8.

基金资助:国家自然科学基金项目(82060151);贵州省科技厅项目(黔科合基础[2020]1Y408,黔科合基础-ZK[2022]一般344,黔科合支撑[2020]4Y230号,黔科合平台人才[2020]4103号);

文章来源:高杰,王明彪,文邦红,等.衰老对小鼠角膜中Pax6和Wnt7a表达的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4160-4164.