糖尿病肾病(DKD)是糖尿病严重并发症之一。DKD显著的病理特点是肾小球基底膜弥漫性增厚及系膜基质增生、扩张等形态学改变，导致肾功能不全，最终发展成终末期肾病(ESRD)[1,2]。研究表明[3],糖尿病患者持续高血糖状态下，诱发氧化应激、炎症等诸多反应，从而导致足细胞、肾小球内皮细胞等肾细胞损伤。其中足细胞作为肾小球滤过膜的最后屏障，在维护滤过膜结构和功能的完整性方面起重要作用[4,5]。足细胞是终末分化的肾小球脏层上皮细胞，高血糖会导致足细胞肥大、凋亡和脱离等病理改变[6]。研究发现[7],DKD早期阶段，足细胞数量减少和相对密度降低，发生足突回缩、融合和消失，随后从肾小球基底膜(GBM)脱落，以活细胞的形式从尿液中排出。因此，尿液中足细胞的数量可作为DKD早期的生物标志物[8],避免足细胞损伤成为防治DKD发生的关键[6,9]。

中医药防治DKD具有丰富的经验，有多组分、多靶点的特点，且毒副作用小，被广泛运用于临床，但其科学内涵仍不清楚。缩泉益肾方由缩泉丸结合海南地域病证特点加味而成，已取得发明专利授权(专利号：ZL201610423677.5),本课题组应用其治疗DKD,前期临床观察疗效较好，可明显改善患者临床症状，缓解病情进展[10],但作用机制尚不明确。本实验拟将缩泉益肾方作用于高糖诱导的小鼠肾脏足细胞，探讨其对足细胞的保护作用及骨架相关蛋白分子结蛋白(Desmin)、α-辅动肌蛋白(actinin)-4水平的影响，以研究缩泉益肾方治疗DKD的作用机制，为其临床治疗DKD提供理论依据。

1、材料与方法

1.1细胞来源

小鼠肾足细胞(MPC-5)购自北纳生物科技有限公司，在添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2的潮湿环境下培养。

1.2药品与试剂

缩泉益肾方：益智仁10 g,乌药10 g,茯苓15 g,丹参15 g,赤芍10 g,苍术10 g,天花粉10 g,以上中药饮片均购自中国北京同仁堂(集团)有限公司，按《中国药典》鉴定均为正品；卡格列净(Med Chem Express公司，货号842133-18-0);DMEM培养基、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号分别为PM150210、40130ES76);0.25%胰蛋白酶(EDTA,法国Biosera公司，货号03-050-1BCS);CCK8试剂盒(Dojindo Laboratories公司，货号CK04);细胞凋亡检测试剂盒[膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)/碘化丙啶(PI)]、逆转录试剂盒[HifairTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR(gDNA digester plus)]、qPCR SYBR Green Master Mix(上海翌圣生物科技股份有限公司，货号分别为11123ES60、11202ES08、40302ES50);EastepTMSuper总RNA提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司，货号LS1040);Desmin、α-actinin-4抗体[BOSTER(美国)公司，货号PB9105、PB1034]。

1.3主要仪器

离心机Heraeus Fresco17(Thermo Fisher Scientific公司);纯水仪(德国Think-Lab, W3T262974);高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific, 75002445);酶标仪(美国Bio Tek, Cytation3);全片扫描仪(日本Olympus, VS120-SL);细胞培养箱(德国Think-Lab, W3T262974)。

1.4缩泉益肾方含药血清制备

SPF级SD雄性大鼠20只，8周龄，体质量(180±20)g,采购于长沙市天勤生物技术有限公司。由海南医学院药物安全评价中心饲养，使用许可证号编号：SYXK(琼)2016-0013,购进后均经防疫检测。本研究经过海南医学院实验动物管理与伦理委员会审查，伦理审批编号：HYLL-2021-219号。饲养温度(24±2)℃、湿度(50±5)%、光照每12 h明暗交替、换风次数15～20次/h的环境中，随机分为2组，普通饲料喂养1 w。空白组灌胃同体积生理盐水，缩泉益肾方(SQYSF)组将缩泉益肾方人的常用剂量按照体表面积转换为动物药物用量[11],给药量7.2 g/(kg·d),灌胃2 ml/次，2次/d,连续灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，大鼠腹主动脉无菌采血；静置2 h,取上清。4℃3 000 r/min离心10 min, 56℃灭活血清30 min, 0.22μm醋酸纤维素膜过滤，-20℃保存备用。

1.5分组及给药

将足细胞正常苏醒，培养在添加10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素混合液(100X)培养基中，置于37℃,5%CO2培养箱内培育并进行传代，直到细胞处于良好的生长状态，并覆盖70%～80%的培养瓶，10～14 d后细胞完全分化，用于实验。将细胞分成6组：正常(N)组、含30 mmol/L葡萄糖的高糖(HG)组、含30 mmol/L葡萄糖+5%缩泉益肾方含药血清(SQYSF-L)组、含30 mmol/L葡萄糖+10%缩泉益肾方含药血清(SQYSF-M)组、含30 mmol/L葡萄糖+20%缩泉益肾方含药血清(SQYSF-H)组、含30 mmol/L葡萄糖+4.45μg/ml卡格列净(Cana)组，将细胞置37℃、5%CO2培养箱中培养，在培养12、24、48 h观察相关结果。

1.6 CCK8法检测细胞存活率

用完全培养液将1 500个/孔的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl,培养24 h后吸弃培养液，正常组用无葡萄糖的DMEM培养，其余用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养细胞48 h,吸弃原培养液，然后按照分组依次处理。继续培养24 h后，所有孔中加入10μl CCK-8测试液，培养箱中孵育，使用酶标仪测定450 nm光吸收值，以溶剂处理的细胞为对照组，不含细胞的培养基为空白组，按公式计算各组细胞存活率。存活率=(对照组-实验组)/(对照组-空白组)×100%。

1.7细胞划痕实验检测细胞迁移能力

取生长期的细胞，以5×104个/孔密度将MPC-5细胞接种于6孔板，当细胞融合度达60%时，按分组处理48 h后，用无菌枪头进行划痕处理，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗次后，随后上药继续培养24 h后，弃取旧液，用PBS清洗3次，随后拍照。培养0、24 h时用显微镜拍照，并计算细胞迁移率，细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%,重复设置3个复孔。

1.8流式细胞术分析细胞凋亡

约1×105每孔的足细胞种在6孔板中，高糖诱导48 h,按上述分组，作用24 h后。用荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)/PI凋亡检测试剂盒收集细胞并染色，然后用流式细胞仪进行分析。根据软件的指示计算AnnexinⅤ+/PI-(早期凋亡)和AnnexinⅤ+/PI(晚期凋亡)细胞的百分比。

1.9实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测不同分组细胞的足细胞骨架相关基因Desmin、α-actinin-4表达

用RNA提取试剂盒提取总RNA,利用逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。然后利用qPCR系统(Quantagene q225-0304,Kubo Tech Co)根据试剂盒制定以下循环条件，扩增目标基因：在95℃预变性5 min;在95℃下变性10 s,退火为60℃30 s,循环次数40次。相对mRNA表达用2-ΔΔCt方法分析数据。在PubMed上设计引物，由北京擎科生物生物技术有限公司合成。目标基因序列(5′-3′):Desmin上游：AGATGAGGGAGCTGGAGGAT,下游：GCGGGCCATCTCATCCTTTA;α-actinin-4上游：ATGGTGGACTACCACGCAG,下游：CAGCCTTCCGAAGATGAGAGT;ACTB上游：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA,下游：GCCGGACTCATCGTACTCC。

1.10 Western印迹检测不同分组细胞的足细胞骨架相关基因Desmin、α-actinin-4表达

用磷酸酶和蛋白酶抑制剂在冷RIPA缓冲液中裂解足细胞。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将5×上样缓冲液加入蛋白溶液中，充分混匀后置于95℃以上水浴变性10 min。通过电泳、转膜、封闭、孵育一抗，按说明书稀释抗体(Desmin,α-actinin-4,β-actin)4℃孵育过夜。用TBST冲洗3次后，加入二抗在室温下孵育2 h。使用电化学发光(ECL)系统和Bio-Rad电泳图像分析仪检测特异性条带。使用ImageJ进行灰度分析。

1.11统计学方法

采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2、结 果

2.1缩泉益肾方对足细胞存活率的影响

与N组[(100.00±0.00)%]比较，HG组细胞存活率[(45.04±2.33)%]显著下降(P<0.01)。与HG组比较，SQYSF-L、M、H组和Cana组细胞存活率[(56.21±0.63)%、(74.65±2.60)%、(57.26±2.87)%、(59.62±4.49%)]均明显增高(P<0.01)。与SQYSF-L、SQYSF-H组比较，SQYSF-M组细胞存活率明显提高(P<0.01),因此，选用缩泉益肾方中剂量作为药物处理剂量。

2.2缩泉益肾方对足细胞迁移的影响

与N组比较，HG组24 h后划痕的宽度明显增加，足细胞划痕愈合率显著降低(P<0.01);与HG组比较，SQYSF-M组和Cana组24 h后划痕的宽度明显减小，足细胞划痕愈合率显著升高(P<0.01);SQYSF-M组足细胞划痕愈合率显著高于Cana组(P<0.05)。见表1、图1。

2.3缩泉益肾方对足细胞凋亡的影响

与N组比较，HG组足细胞凋亡率明显增加(P<0.01);与HG组比较，SQYSF-M组、Cana组足细胞凋亡率明显减小(P<0.01)。见表1、图2。

2.4缩泉益肾方对足细胞骨架相关基因Desmin、α-actinin-4mRNA及蛋白表达的影响

与N组比较，HG组Desmin mRNA及蛋白表达明显增加，α-actinin-4 mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.01);与HG组比较，SQYSF-M组、Cana组Desmin mRNA及蛋白表达均明显减少，而α-actinin-4 mRNA及蛋白表达均显著增加(P<0.05,P<0.01)。见表1、图3。

与N组比较：1)P<0.01;与HG组比较：2)P<0.05,3)P<0.01;与SQYSF-M组比较：4)P<0.05

表1各组足细胞迁移率、凋亡率、Desmin、α-actinin-4 mRNA及蛋白表达比较

图1各组足细胞迁移(×40)

图2缩泉益肾方对足细胞凋亡的影响

图3各组足细胞骨架相关基因Desmin、α-actinin-4蛋白表达比较

3、讨 论

足细胞损伤在DKD的发生发展中至关重要，足细胞既是糖尿病中多种致病因素作用的靶点，同时其损伤也是DKD重要的致病因素[12]。 足细胞骨架与DKD早期产生蛋白尿密切相关，DKD初期，足细胞相关蛋白的表达发生变化，足突的宽度增加，足细胞正常生理结构遭到破坏，造成足细胞骨架重排，肾小球滤过屏障通透性增加，尿中出现蛋白质[13]。Desmin属于Ⅲ类中间丝蛋白。Desmin基本不表达于正常肾组织足细胞，一旦足细胞受损，则见Desmin大量表达，可能是由于足细胞骨架重新排列，出现表型转化，所以可将Desmin视为足细胞遭到破坏的早期标志[14]。α-actinin-4为肌动蛋白交联蛋白，为α-actinin-4家族中的一员，仅在足细胞上表达。α-actinin-4不仅能够维持足细胞形态结构的稳定，而且能保证足细胞的黏附、运动得以正常发挥。一旦α-actinin-4出现异常，将无法正常交联肌动蛋白成束，使肌动蛋白骨架结构遭到破坏，足细胞损伤[15]。

DKD根据病证结合的原则，归属于中医学消渴病继发的“水肿”“虚劳”“关格”等范畴[16]。有人认为在消渴病前期，功能异常导致机体出现热郁、气滞、痰凝、血瘀等病邪的不显著变化，早期呈潜伏隐匿的状态，而后随着病情发展，由经入络，功能和形态相互影响，而形成“微型癥瘕”[17]。缩泉益肾方具有通补兼施，具有温补脾肾，通和脉络之效，针对DKD“伏邪微癥瘕”的病机特点。本课题组多年应用其治疗DKD,前期临床观察疗效较好，可明显降低DKD患者的24 h尿蛋白定量、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平，治疗组的肌酐清除率水平比对照组上升更明显[10];治疗后DKD患者的血清炎症因子白细胞介素(IL)-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平均有明显改善[18];动物实验发现缩泉益肾方能降低DKD小鼠血糖水平，降低尿蛋白、尿肌酐(UCr)和BUN的排泄量，增加过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)活力[19];根据前期网络药理学分析[20],缩泉益肾方活性成分主要包括甾醇类、生物碱类及黄酮类等，在DKD中起到抗纤维化、抗炎、抗氧化及降糖降压、心血管保护功能及降胆固醇的活性等多种能力。另外还发现缩泉益肾方在药效学上体现出影响DKD小鼠肠道菌群的多样性，如增加蓝藻菌门与疣微菌门的相对丰度，减少软壁菌门与放线菌门的相对丰度，减少厚壁菌门与拟杆菌门的比值，从而影响肠道菌群的结构，对DKD产生治疗作用[21]。本研究结果提示，缩泉益肾方可增加高糖诱导的小鼠肾脏足细胞活力，提高细胞划痕愈合率，减少其凋亡，缩泉益肾方可能通过修复细胞骨架相关蛋白分子Desmin、α-actinin-4的异常表达，抑制肌动蛋白骨架重排，稳定细胞骨架，从而减轻足细胞的损伤。本研究为防治DKD提供新的思路和方法，但未探究减轻高糖诱导的足细胞肌动蛋白骨架损伤的确切分子机制，需深入研究。

参考文献:

10尹德辉,朱叶,倪雅丽,等.缩泉益肾方治疗2型糖尿病肾病的临床疗效[J].中国老年学杂志,2019;39(9):2091-2.

11黄继汉,黄晓晖,陈志扬,等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学,2004;9(9):1069-72.

基金资助:国家自然科学基金(81860794,81960855);海南省自然科学基金(2019RC231,821RC690);

文章来源:黄明月,朱叶,谢毅强,等.缩泉益肾方对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞损伤的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4155-4159.