肝纤维化可能由各种病因引起的，如毒性损伤、慢性病毒感染、酗酒、免疫攻击等[1]。肝纤维化的特征是细胞外基质（ECM）的积累，破坏了肝脏的生理结构，导致肝细胞受损和免疫细胞浸润，激活肝星状细胞（HSC)[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1）被认为是HSC活化的最重要的调节因子之一[3]。活化后的HSC从休眠状态到肌成纤维细胞的转化过程，肌成纤维细胞产生了ECM的主要组成部分，如I型胶原（Co L1A1)[4]。肝纤维化进程中首先发生肝脏损伤，当损伤积聚时，生物体首先启动促炎机制，随着炎症反应的发生，肝脏组织的正常结构和生理功能逐渐被破坏，从而导致瘢痕组织的产生，发生纤维化[5]。肝纤维化最终发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌，占全球所有年死亡人数的3.5%[6]。目前临床缺少肝纤维化治疗的有效药物。因此，寻找高效低毒的天然药物及探究相关作用靶点，筛选治疗肝纤维化的候选药物成为当今药学领域研究的热点内容之一。

现代医学研究发现新疆特色药材刺糖提取物具有调节胃肠道功能、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫及抗炎、抗菌、护肝、护肾、抗骨质疏松、抗溃疡、抗糖尿病等作用[7-8]。研究表明，松三糖作为刺糖低聚糖的主要活性成分之一，由α-D-Glcp-(1→3)-β-D-Fruf-(2→1)-α-D-Glcp组成。动物实验表明其能够减少肝脏组织中胶原纤维的积累，恢复肝功能指标，降低白细胞介素（IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的水平[9]。但松三糖治疗肝纤维化的作用机制并不明确。故本研究利用网络药理学和分子对接技术探索松三糖治疗肝纤维化的潜在作用机制。网络药理学基于药理学、计算机等学科发展而来，其可用于预测药物治疗疾病的潜在靶点、作用机制等，可为新药研发提供一定的研究依据[10]。分子对接技术是在分子水平上预测配体和靶点结合能力的一种方法，其广泛运用于计算机辅助药物研发领域[11-12]。结合网络药理学并通过体外实验对部分核心靶点进行验证，以期为后续松三糖用于治疗肝纤维化药物研发提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

松三糖由课题组从维药刺糖中提取并经过结构鉴定，质量分数为99.85%；胎牛血清（Gibco USA);DMEM（杭州沃森生物技术有限公司）；0.25%胰蛋白酶消化液（南京凯基生物科技发展有限公司，货号KGY001-100）；青霉素-链霉素双抗（10 000 U，美国Hyclone公司，货号SV30010),MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（武汉布德生物，货号AR1156），二甲基亚砜DMSO（美国Sigma公司）；Co L1A1(Hua Bio，货号ET1609-68）、TGF-β1（货号AF03634），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，货号CST 4257）、p-PI3K(CST，货号17366）、蛋白激酶B(Akt,CST，货号4691）、pAkt(CST，货号4060）、p38(Proteintech公司，货号14064-1-AP）、p-p38(Proteintech公司，货号28796-1-AP）、细胞外调节蛋白激酶（ERK,Proteintech公司，货号11257-1-AP）、p-ERK(Proteintech公司，货号28733-1-AP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK,Proteintech公司，货号17572-1-AP）、p-JNK(Proteintech公司，货号80024-1-RR),RIPA裂解液（Abcam公司，货号ab156034）；蛋白酶抑制剂（Abcam公司，货号65621）。

1.2松三糖作用靶点和肝纤维化疾病靶点的筛选

Pub Chem数据库获得松三糖的结构，将结构导入Swiss Target Prediction数据库中筛选松三糖治疗疾病相关靶点；以“liver fibrosis”为关键词从OMIM(https://www.omim.org/）、Gene Cards(https://www.genecards.org/）、Disgenet(https://www.disgenet.org/）数据库中筛选出肝纤维化的相关靶点。将靶点信息置于同一文档，整合化合物治疗靶点和肝纤维化疾病相关靶点。

1.3蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

通过微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）将松三糖治疗靶点和肝纤维化疾病靶点进行取交集处理并制作Venn图，从而获得该化合物治疗肝纤维化疾病的潜在靶点。将交集靶点上传到STRING数据库（https://cn.string-db.org/）进行蛋白质互作网络，物种选择“homo sapiens”，设置默认“medium confidence(0.400）”。将tsv格式数据结果导入Cytoscape 3.9.1软件中进行可视化分析。使用Cyto Hubba插件中MCC算法，筛选出前10个关键基因。

1.4基因本体（GO）和京都基因和基因组的百科全书（KEGG）富集分析

利用生物信息学注释数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对治疗肝纤维化疾病的靶点进行基因本体论GO功能富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析选取排名前15位的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF)(P<0.01），利用微生信在线网站绘制可视化GO功能富集图。KEGG富集分析选取排名前25位的显著通路（P<0.005），微生信在线网站绘制可视化KEGG功能富集图。

1.5分子对接

松三糖的3D结构通过Pub Chem数据库获得（保存为SDF文件）。其次在PDB(https://www.rcsb.org/）数据库下载靶点蛋白结构，保存为Moe文件。对已下载的蛋白要在MOE软件中先进行一系列预处理过程，包括进行结构性问题的修正、质子化、删除未结合的水分子、能量优化等。接下来以预处理过的蛋白为受体，以化合物为配体，进行蛋白与小分子化合物之间的分子对接。

1.6细胞培养

小鼠肝星状细胞系JS-1由中国药科大学生命科学技术学院刘畅教授课题组赠送。JS-1细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基添加10%胎牛血清、100 IU/m L青霉素和100μg/m L链霉素。细胞保存在37℃加5%CO2的加湿培养箱中。

1.7 MTT实验

将处于对数生长期的JS-1细胞以5×104个/m L的密度接种于96孔板中，每孔100μL(5 000个/孔），继续培养24 h。将96孔板中的细胞液吸出，并加入0、5、10、20、40、80、100μg/m L松三糖，每孔100μL，继续培养24 h。每孔加入5 mg/m L MTT溶液10μL，培养4 h，弃去旧液，加入DMSO溶液，每孔150μL，震摇10 min，使用酶标仪在490 nm处测定吸光度（A）值。根据A值来计算细胞活力。需进行3次独立重复实验，每组6个复孔。

细胞存活率=1-(A对照-A给药）/（A对照-A空白）

1.8 Western blotting实验

将JS-1细胞分为对照组、模型组及松三糖（20、40μg/m L）组。用2.5 ng/m L的TGF-β1刺激JS-1细胞12 h构建肝纤维化模型[13]，松三糖组用含20、40μg/m L松三糖培养基处理24 h后在含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA溶液中进行细胞裂解。将所得悬浮液在4℃下以12 000 r/min离心20 min，以分离上清液。在还原条件下，变性后的蛋白通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，随后转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。然后用5%BSA在室温下封闭1 h。随后，将其与抗Co L1A1、PI3K/Akt及抗P38、ERK、JNK抗体在4℃下孵育过夜。用TBST缓冲液对膜进行3次洗涤，然后与羊抗鼠/兔辣根过氧化物酶（HRP）二抗（1∶5 000）在室温下孵育1 h。最后，使用ECL方法对膜上的蛋白条带进行可视化，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参进行定量分析，使用Image J软件进行定量强度分析。

1.9统计学方法

使用Graph Pad Prism 8.0软件处理数据。所有数据均用表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差ANOVA分析。

2、结果

2.1松三糖作用靶点预测结果

将绘制好的松三糖化合物结构导入Swiss Target Prediction数据库中筛选松三糖治疗疾病相关靶点，共得到92个潜在作用靶点。

2.2肝纤维化疾病靶点筛选结果

从OMIM(https://www.omim.org/）、Gene Cards(https://www.genecards.org/）、Disgenet(https://www.disgenet.org/）数据库中筛选出肝纤维化的相关靶点，共得到9 962个有关肝纤维化潜在靶点。

2.3松三糖治疗肝纤维化潜在作用靶点的获得

肝纤维化的作用靶点与松三糖的治疗靶点通过取交集，获得70个交集靶点，即为松三糖治疗肝纤维化的潜在作用靶点，见图1。

图1松三糖与肝纤维化靶点韦恩图

2.4松三糖治疗肝纤维化作用靶点PPI网络分析

PPI网络分析包括74个节点，见图2A。将结果导入Cytoscape 3.9.1进行可视化分析，利用Cyto Hubba插件中的MCC算法，计算出前10位的基因，见图2B，分别为信号转导子和转录激活子3(STAT3）、相对分子质量9×104热休克蛋白αA1(HSP90AA1）、多巴胺受体D2(DRD2）、非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1(PTPN1）、激酶插入域蛋白受体（KDR）、细胞色素P4502D6(CYP2D6）、白细胞介素-2(IL-2）、ATP结合盒亚族B成员（ABCB1）、蛋白激酶Cα(PPKCA）、PPKCB等。

图2松三糖治疗靶点与肝纤维化靶点PPI网络图（A）、排名前10位的关键基因（B)

2.5 GO和KEGG富集分析结果

对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示共富集到298个条目，包括199项BP、48项CC和51项MF。从BP、CC和MF中各选取富集程度最高的前10项，其中最具有代表性的是BP,ERK1和ERK2级联的正向调控、环化酶激活肾上腺素受体信号通路、突触囊泡外吞的调控、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的正调节等，见图3。富集到64条KEGG信号通路，见图4。主要包括TRP通道的炎症介质调节、钙信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗、Rap1信号通路、PI3K/Akt信号通路、血管平滑肌收缩、低氧诱导因子-1(HIF-1）信号通路、MAPK信号通路等。

2.6分子对接

采用分子对接技术对KEGG富集靶点信号通路PI3K/Akt及MAPK的相关靶点蛋白进行对接，探究松三糖与这些靶点蛋白的结合能力。结果表明松三糖和PI3K/Akt,P38、ERK、JNK结合能分别是-6.3、-7.5、-6.2、-6.0、-6.6 kcal/mol(1 cal=4.4J），见表1、图5。松三糖与核心靶点的结合能均<-5 kcal/mol。

图3 GO富集分析结果

图4 KEGG富集分析结果

2.7松三糖对JS-1细胞活力的影响

0、5、10、20、40、80、100μg/m L松三糖分别处理JS-1细胞24 h后，通过MTT法检测各组细胞的细胞活力，细胞抑制率均低于10%，表明松三糖对细胞无显著毒性，见图6。

表1松三糖与靶点的结合能

图5松三糖和核心靶点的分子对接结果

2.8 Western Blotting检测结果

如图7所示，Western blotting结果表明，松三糖减少TGF-β1诱导的JS-1细胞中的I型胶原积累，且以剂量相关性地方式下调JS-1细胞中p-PI3K、pAkt、p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白的表达（P<0.05、0.01、0.001）。

3、讨论

肝纤维化是慢性炎症向肝硬化的过渡阶段，其病理过程是可逆的[14]。近年来，从药用植物中提取高效、低毒的有效成分以减轻肝纤维化的研究越来越受到重视。本研究通过网络药理学、分子对接然后结合细胞试验，探究了从刺糖中提取的活性成分松三糖对肝纤维化的保护作用及可能的作用机制。

通过构建PPI网络得到排名前10位的基因，分别为STAT3、HSP90AA1、DRD2、PTPN1、KDR、CYP2D6、IL-2、ABCB1、PPKCA、PPKCB等。STAT3在肝病的发病机制中起着关键作用[15]。据报道，STAT3是一种细胞质信号转录因子，属于Janus激酶信号转导和转录激活因子STAT通路，在肝损伤过程中起着至关重要的作用。当STAT3持续被激活时，会导致各种病理表现[16-17]。近年来，研究证明，STAT3与各种因素引起的肝纤维化的发生发展密切相关。STAT3的激活在肝纤维化的发病机制中起到抗炎或促炎作用[18]。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B，由PTPN1编码）是一种广泛表达的非受体磷酸酶，可调节信号转导的许多方面，PTP1B缺乏在肝损伤的啮齿动物模型中具有保护作用，包括FAS诱导的肝衰竭、对乙酰氨基酚过量引起的肝毒性以及胆管结扎诱导的纤维化[19-20]。

图6松三糖对JS-1细胞存活率的影响n=3)

图7松三糖对JS-1细胞Co L1A1、PI3K/Akt及MAPK信号通路蛋白表达的影响n=3)

GO分析显示松三糖参与缓解肝纤维化进程的生物过程包括ERK1和ERK2级联的正调节、ERK1和ERK2级联的正向调控、环化酶激活肾上腺素受体信号通路、突触囊泡外吞的调控、MAPK级联的正调节等。KEGG通路富集分析显示松三糖可能通过PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路等治疗肝纤维化。在肝脏中，PI3K通路已被充分证明是调节细胞生长、增殖、存活和迁移的重要信号传导。生长因子与酪氨酸激酶受体结合后，PI3K被激活，进而诱导Akt磷酸化[21]。抑制Akt磷酸化可抑制HSCs活化，改善胶原蛋白和ECM沉积，并诱导HSCs凋亡[22-23]。细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2）和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在各种细胞过程中起着至关重要的作用，包括细胞因子的产生、增殖和细胞凋亡。这些途径可能会在肝脏中引发纤维化。许多研究提供了支持MAPK信号转导在纤维化中的作用的信息[24-25]。

最后，通过分子对接技术验证了松三糖与各核心靶蛋白之间的结合能力。结果显示，松三糖与PI3K/Akt、P38、JNK、ERK等靶蛋白均有较好结合活性。并通过Western Blotting实验表明松三糖减少TGF-β1诱导的JS-1细胞中I型胶原的积累，降低了磷酸化的PI3K、Akt、P38、JNK、ERK的表达，从而缓解纤维化进程。综上所述，松三糖可能通过作用于PI3K/Akt及MAPK等多个靶点，发挥抗肝纤维化作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

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基金资助:新疆维吾尔自治区重大科技专项项目(2022A03019-3);新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2022D01D37);

文章来源:吕志远,宋建忠,曹玲玲,等.基于网络药理学及实验验证探究松三糖治疗肝纤维化的作用机制[J].现代药物与临床,2024,39(10):2477-2483.