支气管哮喘是一种由多种炎症细胞和细胞因子共同参与的气道慢性炎症性疾病,因其具有气道高反应性､可逆性气流受限和黏液分泌过多等特性,哮喘患者往往表现为反复出现的咳嗽､喘憋､气促[1]｡有调查显示,我国18岁以下人群中哮喘的患病率约为7.5%[2]｡目前对于哮喘的临床治疗主要是减少哮喘的急性发作和改善患者生活质量,指南推荐用于治疗儿童哮喘的药物有吸入性糖皮质激素(ICS)､β2受体激动剂､白三烯受体拮抗剂等[3];哮喘的控制是一个长期的过程,这些药物的使用可能会产生相应的不良反应,患儿家属在治疗过程中对医嘱的依从性较差,很难产生理想的疗效[4⁃5]｡研究显示,临床症状能得到有效控制的哮喘患儿不足20%[6]｡小儿定喘口服液组方最早可在张仲景经方麻杏石甘汤加减方中,结合三子养亲汤加减中见到｡以麻黄和苦杏仁(炒)为君药,紫苏子､葶苈子､莱菔子为臣药,石膏､黄芩､桑白皮､大青叶､鱼腥草为佐药,甘草为使药,不仅能有效清除肺内郁热,还有化痰平喘的功效[7⁃8]｡网络药理学作为一门综合性强的学科,具有完整性､系统性特点,类似于中药多靶点､多途径､多成分的功能特点[9]｡现基于网络药理学,构建药物､疾病､靶点之间相互作用的网络,预测小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的核心成分及靶点,分析其治疗疾病的作用机制,为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘提供依据和参考｡

1、材料与方法

1.1小儿定喘口服液成分靶点的获取

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp⁃e.com/tcmsp.php),设定口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,类药性(druglikeness,DL)≥0.18,分别筛选麻黄､苦杏仁(炒)､紫苏子､葶苈子､莱菔子､桑白皮､黄芩､石膏､鱼腥草､大青叶､甘草的活性成分｡通过PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性成分的“CanonicalSMILES”,输入SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/),筛选probability>0的成分靶点｡

1.2儿童哮喘靶点的获取在在线人类孟德尔遗传数据系统(OMIM)及GeneCards数据库中,输入关键词“childhoodasthma”,筛选相关性分数(relevancescore)>2的靶点,两个数据库合并,删除重复靶点即为儿童哮喘的疾病靶点｡再将上述得到的小儿定喘口服液的成分靶点与儿童哮喘的疾病靶点导入微生信平台,绘制韦恩图,输出共同靶点即为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的作用靶点｡

1.3“药物⁃成分⁃靶点”网络的构建

基于小儿定喘口服液的活性成分､成分靶点､共同靶点制作网络文件和属性文件,在CytoScape软件中依次导入两个文件,绘制“药物⁃成分⁃靶点”网络｡网络中节点代表成分和靶点,边代表成分和靶点的关系,借助工具CytoNCA进行网络拓扑分析,将连接度(degree)､紧密度中心性(closeness)､介度中心性(betweenness)从大到小进行综合排序,排序越靠前表明节点越重要,选取排在前10位的成分作为核心成分｡

1.4蛋白相互作用(PPI)网络的构建

将小儿定喘口服液与儿童哮喘的共同靶点导入STRING数据库,点击“multipleproteins”,将物种设置为人(Homosapiens),高置信度(highconfidience)为0.7,隐藏网络中断开连接的节点(hidedisconnectednodesinthenetwork),进行PPI分析,将结果以TSV格式导出,借助CytoScape软件绘制PPI网络,通过CytoNCA工具进行网络拓扑分析,筛选得到核心靶点｡

1.5GO富集分析和KEGG通路富集分析

将共同靶点导入DAVID数据库,并将物种设置为人(Homesapiens)进行基因本体(GO)富集分析､京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析｡其中,GO富集分析包括3个部分:生物过程(BP)､分子功能(MF)､细胞组成(CC)｡P值越大越可靠,取P前20的通路,借助微生信平台绘制气泡图｡

2、结果

2.1小儿定喘口服液的活性成分及成分靶点

通过TCMSP数据库,限定“口服生物利用度(OB)≥30%､类药性(DL)≥0.18”筛选获得麻黄23个､苦杏仁19个､莱菔子3个､紫苏子16个､黄芩36个､桑白皮32个､大青叶10个､鱼腥草7个､甘草92个及葶苈子12个活性成分｡通过阅读文献可获得石膏活性成分1个,剔除重复项及无靶点成分后,得到麻黄19个､苦杏仁17个､紫苏子8个､黄芩30个､桑白皮18个､大青叶6个､鱼腥草2个､甘草65个及葶苈子7个活性成分｡将PubChem数据库中获得每种活性成分的“CanonicalSMILES”输入SwissTargetPrediction数据库,筛选得到10781个probability>0的成分靶点,剔除重复项后得到小儿定喘口服液成分靶点931个｡

2.2儿童哮喘相关靶点的获取

检索OMIM及GeneCards数据库,分别获得2638､149个儿童哮喘靶点,两个数据库合并去重得到疾病靶点2787个｡借助微生信平台,绘制韦恩图(图1),获得两者的共同靶点404个,作为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的作用靶点｡

图1小儿定喘口服液与儿童哮喘靶点韦恩图

2.3小儿定喘口服液与儿童哮喘“药物⁃成分⁃交集靶点”网络

在CytoScape中导入小儿定喘口服液活性成分､药物与疾病共同靶点,构建“药物⁃成分⁃靶点”网络图,图中圆形代表靶点,线代表它们之间的关系,degree值越大,图形越大,结果越可靠｡综合degree､closeness､betweenness筛选得到光甘草定､黄芩素､汉黄芩素等10个成分为核心成分｡见图2､表1｡

图2小儿定喘口服液与儿童哮喘药物⁃成分⁃交集靶点网络

表1小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的核心成分信息表

2.4PPI网络的构建及核心靶点分析

将以上获得的404个共同靶点导入STRING数据库,选择“multipleproteins”“Homosapiens”“minimumrequiredinteractionscore(highconfidience0.7)”“hidedisconnectednodesinthenetwork”进行PPI分析,将以TSV格式导出的结果利用CytoScape软件绘制成PPI网络图(图3),借助CytoNCA工具进行网络分析,综合degree､betweenness､closeness值,表皮生长因子受体(EGFR)､白细胞介素⁃6(IL⁃6)､信号转导和转录激活因子3(STAT3)等10个排名靠前的靶点可能为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的核心靶点,见表2｡

图3小儿定喘口服液与儿童哮喘交集靶点PPI网络

表2小儿定喘口服液治疗儿童哮喘核心靶点

2.5交集靶点GO和KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库对小儿定喘口服液与儿童哮喘的404个共同靶点进行GO和KEGG通路富集分析,小儿定喘口服液治疗儿童哮喘主要涉及的条目包括炎症反应､蛋白质磷酸化､胞浆钙离子浓度的正调控等1242个BP;质膜､脂筏､受体复合物等143个CC;蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性､酶结合､ATP结合等265个MF｡KEGG通路富集分析结果显示,小儿定喘口服液治疗儿童哮喘涉及186条信号通路,包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)⁃蛋白激酶B(Akt)､丝列原活化蛋白激酶(MAPK)､钙离子等信号通路,借助微生信平台将P值排名前20的条目分别绘制成气泡图｡见图4､图5｡

图4KEGG通路富集分析

图5GO基因功能富集分析

3、讨论

中医学认为,哮喘的发病机制是宿痰内伏于肺,痰气郁结,堵塞气道,肺热难以排出;“宿痰内伏”是哮喘的根源｡最早可见于张仲景《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证治》:“膈上病痰,满喘咳吐,发则寒热,背痛腰痛,目泣自出,其人振振身瞤剧,必有伏饮”[10⁃11]｡小儿定喘口服液包含11味中药成分:麻黄､苦杏仁(炒)､紫苏子､葶苈子､莱菔子､黄芩､石膏､桑白皮､大青叶､甘草､鱼腥草｡麻黄为麻黄科麻黄属植物草麻黄､中麻黄或木贼麻黄的干燥草质茎,性温,味辛､微苦,能发汗散寒､宣肺平喘､利水消肿｡麻黄的主要成分为麻黄碱,可调节卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Terg细胞免疫失调,降低血清IgE水平,抑制炎症细胞浸润,有效抑制过敏反应,对支气管哮喘治疗有效｡苦杏仁是蔷薇科杏的种子,有降气､止咳､平喘､润肠通便的功效,主要用于咳嗽气喘､胸满痰多､血虚津枯､肠燥便秘患者｡从苦杏仁中提取到的苦杏仁苷可作用于咳嗽中枢延髓,减轻哮喘患者的咳嗽症状｡紫苏子的化学成分多是一些多元酚类物质,能减轻哮喘患者的过敏反应,缓解其急性发作时的临床症状｡葶苈子通过止咳､抗菌､抑制花生四烯酸代谢发挥抗哮喘作用｡莱菔子的化学成分β⁃谷甾醇可化痰､平喘､止咳｡生石膏味辛､甘,微寒,归肺､胃经,具有解肌清热的疗功效,能减少OVA诱导的嗜酸粒细胞和中性粒细胞增多,还可通过激活Ahr/C⁃myc途径诱导炎症细胞凋亡,缓解哮喘患者的慢性气道炎症｡黄芩能够抑制白三烯B4/C4及前列腺素E2的生物合成,有清热､止咳的功效｡桑白皮和大青叶都具有消炎杀菌作用｡鱼腥草可清热解毒､化痰平喘｡甘草可增强肺部血供,有润肺之效[7,12]｡小儿定喘口服液可抑制肥大细胞脱颗粒,抑制炎症因子的释放,松弛痉挛的支气管平滑肌,延长乙酰胆碱引发喘息的潜伏期,具有解挛定哮､宣肺平喘的功效[13]｡

本研究基于网络药理学探讨小儿定喘口服液治疗儿童哮喘相关机制,通过分析“药物⁃成分⁃靶点”网络发现光甘草定､黄芩素､汉黄芩素等为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的核心成分｡有研究表明,光甘草定可减少血液和肺泡灌洗液中炎症细胞数量,抑制环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX),抑制炎症介质产生,降低血清IgE水平,从而缓解哮喘小鼠的气道炎症和气道高反应性[14]｡黄芩素可通过减少气道平滑肌增生和胶原沉积,抑制IL⁃4和IL⁃13的产生以及炎症细胞的迁移和活化来减轻OVA诱导的小鼠气道炎症和气道重塑,其作用机制可能与抑制血管内皮生长因子A(VEGFA)､EGFR的表达和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化以及Th2细胞因子的产生相关[15]｡汉黄芩素可调节IL⁃4/STAT6信号通路在治疗哮喘方面具有潜在价值,汉黄芩素可以通过抑制Th2细胞因子诱导的STAT6激活以及嗜酸粒细胞趋化因子的表达,抑制嗜酸粒细胞炎症,降低总IgE和OVA特异性IgE水平,减轻哮喘小鼠模型中OVA诱导的气道炎症[16]｡

PPI网络分析结果表明,EGFR､IL⁃6､STAT3等可能为小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的关键靶点｡EGFR是人类表皮生长因子受体家族中的一员,与其下游PI3K均可调节气道上皮细胞功能｡有研究[17]表明,持续上皮损伤会促进EGFR､PI3K活化,导致其过度表达,诱导细胞外信号调节激酶传导通路活化,促进表达呼吸道黏蛋白(MUC5AC)､杯状细胞增生和分泌呼吸道黏液,最终导致气道重塑加重｡因此,可通过下调EGFR和PI3K的表达,抑制气道重塑,发挥治疗哮喘的效果｡IL⁃6是一种炎症细胞因子,可通过sIL⁃6R反式信号传导下调Th2细胞的主转录因子GATA结合蛋白3(GATA⁃3),并对IL⁃4､IL⁃5和IL⁃13的生成起到抑制作用,在控制哮喘小鼠Th2细胞功能中发挥重要作用[18]｡Th17细胞表达IL⁃17A､IL⁃17F､IL⁃21､IL⁃22､粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子和IL⁃23R,STAT3磷酸化促进Th0细胞向Th17细胞的转化,与黏液分泌以及气道炎症､气道高反应性和气道重塑相关,在哮喘小鼠模型中通过STAT3抑制剂阻断Th2和Th17途径可有效减少肺部炎症[19]｡

KEGG通路富集分析结果显示,小儿定喘口服液可能通过PI3K⁃Akt､MAPK､钙离子等信号通路发挥预防和治疗儿童哮喘的作用｡PI3K⁃Akt信号通路影响气道平滑肌细胞增殖和气道黏液分泌,与支气管哮喘发病关系密切[20]｡细菌受体蛋白⁃39/人软骨糖蛋白⁃40(BRP⁃39/YKL⁃40)对平滑肌细胞的增殖和迁移有刺激作用,在Th2诱导的炎症反应､细胞因子调控和哮喘气道重构中发挥重要作用,依靠PI3K/AKT/PKB信号通路活化,抑制PI3K/AKT信号通路能减轻OVA诱导哮喘模型的气道重构[21]｡PengW等[22]研究发现,成纤维细胞生长因子10(FGF10)能显著抑制体内嗜酸粒细胞和Th2细胞因子(IL⁃4､IL⁃5和IL⁃13)的积累,PI3K/AKT/NF⁃KALB通路可通过调节FGF10对哮喘炎症发挥抑制作用｡MAPK家族由3种蛋白激酶组成,包括p38MAPK､细胞外信号调节激酶(ERK)和c⁃JunNH2⁃末端激酶(JNK),在实验性哮喘模型中,MAPK通路的激活介导炎症因子的产生和活化,可调节细胞生长､增殖､趋化作用等多种生物过程,与气道炎症密切相关[23⁃24]｡钙离子通道是细胞重要的离子通道之一,可调节支气管平滑肌收缩,参与生成炎症介质和细胞因子,与气道慢性炎症､气道高反应性和气道重塑有很大关系[25]｡GomesB等[26]研究表明,钙通道阻滞剂选择性抑制钙离子依赖性细胞因子IL⁃4､IL⁃5和IL⁃13的产生,阻碍了Th2介导的气道炎症的发展,从而有利于哮喘治疗｡

本研究通过网络药理学方法发现,小儿定喘口服液可能通过光甘草定､黄芩素､汉黄芩素等172个活性成分,作用于EGFR､IL⁃6､STAT3等404个靶点,调控PI3K⁃Akt､MAPK､钙离子等187条信号通路发挥治疗哮喘的作用｡然而,网络药理学具有一定的局限性:(1)网络药理学研究是一种实验性预测,以各种数据库为基础,目前对靶点及成分的筛选以及数据库的选择缺乏统一的标准,且受技术水平影响,收集的数据缺乏一定的完整性和时效性,结果存在一定的偏差｡(2)中药复方治疗疾病存在剂量效应,不同的药物剂量配伍后产生的药效不同,通过数据库对于各中药成分检索只能是定性,不能量化｡(3)网络药理学是一种静态网络分析,不能体现中药在机体内的复杂变化,结果容易被外界环境所干扰,其具体作用机制还有待进一步体内外实验加以验证｡

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基金资助:国家自然科学基金项目,编号81701587;山东省中医药科技项目,编号M-2022227;

文章来源:郝梦缘,林荣军,刘冬云,等.基于网络药理学探讨小儿定喘口服液治疗儿童哮喘的作用机制[J].儿科药学杂志,2025,31(02):5-11.