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分析研究卡托普利片生物等效性

2020-07-11 368 上传者：管理员

摘要：卡托普利为血管紧张素转换化酶抑制药,其制剂临床上用于治疗高血压和心力衰竭。由于其化学结构的特殊性,在生物等效性研究的生物样品分析过程中,需要对样品处理方法、检测方法进行充分考察,所用方法不同,最终得出的检测结果也不尽相同。无论采用何种处理方法,都应对该方法进行科学全面的验证,以确保最终结果的可靠性。

关键词：
临床药理学
二硫化物
卡托普利
生物样品分析
生物等效性研究
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卡托普利为血管紧张素转化酶抑制药,通过减少血管紧张素Ⅱ的生成、减少缓激肽水解而降低血压,并可通过扩张小动脉和小静脉,减轻心脏前、后负荷,其制剂临床上用于治疗高血压和心力衰竭。由于卡托普利结构中具有巯基,容易形成二硫化物,在人体代谢方面,在24 h内尿液中大于95%的吸收剂量被消除,40%～50%的药物为原型,其余为无活性的二硫化物代谢物(卡托普利二硫化物和卡托普利半胱氨酸二硫化物)。随着仿制药质量和疗效一致性评价的开展,卡托普利片的生物等效性研究数量也逐渐增加。因此其试验及生物样品分析过程均应进行相应的考虑。

1、试验设计

美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)说明书[1]显示胃肠道中食物的存在使卡托普利的吸收减少约30%～40%,因此要求应在餐前1 h服用。我国地产化卡托普利片说明书中也显示,胃中食物可使本品吸收减少30%～40%,故宜在餐前1 h服药。基于以上考虑,《289基药目录中可豁免或简化人体生物等效性试验品种名单》[2]中将12.5 mg和25.00 mg规格卡托普利片列入简化品种名单,仅需开展空腹生物等效性(Bioequivalence,BE)研究。此外,FDA卡托普利片个药指南[3]中同样要求仅开展空腹研究。

2、血样采集与处理

建议采集血浆样品,由于卡托普利容易形成二硫化物,因此在样品采集及处理过程中应采取特殊处理,其反应过程,见图1[4]。

2.1二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原法

DTT是一种很强的还原剂,能够实现对二硫键的还原,与二硫化物发生反应[5],见图2。

图1卡托普利二硫化物的合成

图2二硫苏糖醇与二硫化物反应过程

DTT可以在采血完成后立即加入,也可在样品前处理过程中加入。

2.1.1采血完成之后立即加入DTT

在加入DTT之前需要根据预估的血药浓度对加入DTT的量及反应时间进行探索,确保卡托普利原型不被进一步氧化。同时还应对DTT的还原能力进行考察,以确保DTT的用量及反应时间能够将受试者血浆样品中所有卡托普利二硫化物转化完全。

DTT是一种很强的还原剂,散发难闻的气味,可因吸入、咽下或经皮肤吸收而危害健康。因此,出于对受试者安全的考虑,不建议提前将DTT预先加入真空采血管后再进行采血。但卡托普利形成二硫化物的反应在体外也会发生,因此建议采血至加入DTT之间的时间间隔应尽量减少。

2.1.2样品前处理过程中加入DTT

若在样品前处理过程中加入DTT,样品采集过程中可不做特殊处理,但同样需要根据预估的血药浓度对加入DTT的量及反应时间进行考察,以确保所有卡托普利能够转化完全。或通过随行卡托普利二硫化物质控(完全转化后的浓度对应质控浓度)来监控卡托普利二硫化物是否完全转化为卡托普利单体。

2.2其它还原剂法

也可使用其他还原剂实现阻止卡托普利进一步氧化或将二硫化物转化为卡托普利的目的,但应对所用还原剂的反应原理、还原剂的还原性强度、加入剂量及反应时间进行充分的调研及探索。根据其反应原理及目的的不同,可在不同阶段加入还原剂。对于对人体无伤害的还原剂,可预先加入真空采血管后再进行采血。

3、生物样品分析

根据样品处理过程中加入还原剂的不同,可以采用不同的方法进行检测。

3.1直接分析

若样品处理过程中加入的还原剂的量能够保证二硫化物全部转化为卡托普利并且卡托普利不会再次形成二硫化物,或者加入的还原剂具有足够强的还原性,能够阻止采集样品中的卡托普利原型进一步发生氧化反应,则可以直接进行卡托普利的检测。采用直接分析方法用于定量分析的监测母离子应为m/z 218.3(卡托普利)。

3.2衍生化后分析

若样品处理过程中加入的还原剂不足以保证卡托普利的长时间稳定,则需在样品检测前处理过程中将卡托普利进行衍生化,如加入衍生化试剂对溴苯甲酰甲基溴(p-BPB)[6]。同时需要对加入衍生化试剂的量及时间进行考察,以便实现卡托普利原型的衍生化程度能够完全。采用衍生化方法用于定量分析的监测母离子应为卡托普利衍生化物。

4、结果

采用的处理方法不同,最终检测的卡托普利来源就不同,造成各种方法得出的结果差异较大。

以药时曲线下面积(area under the cure,AUC)为例,采用加入DTT后直接分析得到的AUC结果,约为加入其他还原剂(二硫化物未发生转化)后进行衍生化分析的结果的6倍,见图3。

图3两种处理方法获得药时曲线下面积(AUC)结果比较

5、已测样品再分析(incurred sample reproducibility,ISR)

由于卡托普利及其二硫化物之间存在回复转化的可能,在ISR考察过程中或许存在结果不被接受的情况。若试验过程中出现ISR考察不合格时,可能是由于卡托普利形成二硫化物导致,应在充分调查的基础上进行科学合理的解释。

6、讨论

鉴于卡托普利的特殊性,在样品处理过程中需要在评估血药浓度的基础上加入还原剂,但对于加入还原剂的反应原理、还原性强度、加入剂量、在什么阶段加入及反应时间都要进行充分研究,以便为后续检测提供保障。

卡托普利样品在不加入还原剂的情况下,体外也能发生形成二硫化物的反应,因此应尽量减少采血至加入还原剂之间的时间间隔。如所用还原剂对人体无安全性风险,建议预先将还原剂加入真空采血管中,之后再进行采血。

若使用DTT作为还原剂,使用体外制备的卡托普利样品仅能用于评价DTT抑制卡托普利氧化的程度,但实际待测血浆样品中同时还存在一定量的卡托普利二硫化物代谢物,而DTT又能实现二硫化物转化为卡托普利,因此建议同时考察方法所用的DTT的量及反应时间是否能够保证二硫化物完全转化为卡托普利。

若采用涉及到衍生化的方法时,衍生化试剂的含量及衍生化时间也会影响到最终检测结果,建议对加入衍生化试剂的量及衍生化时间是否充分都要进行探索。

也可采用其他方法对卡托普利进行处理,但需要对该方法的科学性及可靠性进行充分验证。无论采用何种方法,建议在前期方法开发过程中,对样品采集、前处理及分析过程进行充分科学合理的探索,以确保所用方法准确可靠,从而确保最终检测结果的准确性。