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中药复方中总黄酮提取工艺及药理作用研究
摘要：目的：探索中药复方中黄酮最佳工艺，研究各因素对其抗氧化能力的影响差异。以中药复方为实验材料进行响应面优化实验，并测定黄酮的抗氧化能力。经响应面实验证实提取复方中黄酮的最佳工艺为回流温度84℃、回流时间2h、料液比1∶30mg•mL-1，此时黄酮的占比为4.51%。体外药理实验表明：DPPH清除率为85.66%，纤体复方中总还原力为0.89Abs，为抗坏血酸的0.67倍，该复方具有显著的抗氧化活性。
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根据卫生部官方统计，我国高血脂发生率高达25%，并且有日益广泛化的趋势。高血脂症不仅受遗传因素的影响，与后期的生活习惯、饮食健康、起居睡眠等息息相关。高血脂症可紊乱脂质代谢，引发多种慢性疾病，影响生命质量[1]。体内脂质排泄异常，可引起血管硬化，间接诱发供血不足甚至心肌梗塞[2]。
近年来，国外常用降脂药多以人工合成为主，副作用显著，临床验证其见效快但易伤脾胃，所以中药降血脂愈来愈受到人们的喜爱[3,4]。高血脂症可导致肝失疏泄、脾胃失调、气虚血弱[5]，决明子、荷叶、薏仁等中药经研究都具有较好的降血脂功效。本实验旨在研究实验室研究自制降脂复方清除自由基能力和抗氧化活性，以期为制备降血脂新药提供实验基础。
陈俊其[6]等优选三种不同溶剂提取黄酮，结果表明黄酮在乙醇中溶解最充分，因此本次提取溶剂选用乙醇。黄酮在高温下因结构不稳定而分解，降低溶出率[7]，本实验采用超声波辅助乙醇加热回流的方法，可加快提取进程，增大溶解度。
本次实验以中药复方中黄酮得率为目的，设计响应面实验，研究回流时间、回流温度、料液比对最终实验的影响[8]，测定抗氧化活性。
1、试剂与器材
DPPH、亚硝酸钠、芦丁对照品[9]；离心机、双频恒温数控超声波清洗器、旋转蒸发仪、恒温水浴锅等[10]。
2、实验部分
2.1含量测定
2.1.1芦丁标曲
按照规定方法绘制标准曲线。回归方程y=0.5029x+0.0075,R2=0.9983,R2>0.998表明所得方程具有可行性和线性关系。
2.1.2总黄酮含量测定
量取30mL新配制的80%乙醇溶液倒入1.00g中药粉末，密封超声20min，加热回流，分离上清液，定容稀释，低温密封保存。移液枪吸取1mL，测定其吸光度[11]。
2.1.3单因素实验
同上述黄酮测定方法，测定吸光度值，生成趋势表，最高点所对应的水平即为该因素的最佳工艺。
2.1.4响应面实验
分析3个自变量的改变对响应值作用的规律，在单因素实验的数据分析上，设计响应面优化选取最佳提取组合[12]，见表1。
表13因素3水平实验设计
2.2抗氧化能力测定
2.2.1DPPH自由基清除率
配制DPPH储配液，避光冷藏保存。参照下表加样进行实验，结合空白组，计算DPPH清除率[13]。
表2实验加样表
2.2.2总还原力
根据最新版药典标准方法测定总还原力[14]，测定700nm下稀释溶液的吸光度，同时以不同梯度的Vc作阳性对照，评价中药复方中黄酮的氧化还原能力。
3、实验结果
3.1响应面实验
以复方黄酮得率为目的，根据回归模型，得到总黄酮得率Y与3个变量间的线性关系：
分析ANVOA结果，A（料液比）、B（回流温度）作用于实验结果比C（回流时间）明显；F值=9.82,P值<0.05,表明黄酮得率与各考察结果之间密切相关[15]，实验结果可靠；根据R2=0.8763,R2adj=0.9130，即实验结果几乎不受误差影响16]，该回归模型的建立较为可靠。F值可表示各变量与实验结果之间的关系密切程度，依次为C>B>A[17]。
表3响应面设计及结果
表4显著性分析
3.2响应面交互作用分析
响应面分析图可用于确定最佳工艺参数，曲面弯曲程度与该因素对实验结果的敏感程度相关[18]。由图1可知，保持回流温度80℃，黄酮浸出物量会随着回流时间延长而显著变多，在所选范围内，存在最大值[19]。
图1回流时间和温度对含量的作用
根据图2，响应面相对较倾斜，等高线排列相对不紧密，因此回流温度和料液比对实验结果主要是由其共同作用引起，与回归模型分析结果一致，最高点即为固定回流时间不变只考虑温度和料液比影响时总黄酮得率的最大值[20]；料液比曲面比回流温度曲面更为倾斜，更占优势[21]。
图2温度和料液比对含量的作用
根据图3，响应面起伏坡度较大，等高线弯曲程度较大，推断回流时间和料液比对黄酮测定作用较大，交互作用较小，与方差分析吻合；固定回流温度，随着提取溶剂的增多，更有利于黄酮的溶解，达到饱和后黄酮类物质不再浸出，时间延长致使黄酮分解，蛋白和多糖类物质从细胞中流出，导致提取的溶液中杂质过多[22]。
3.3抗氧化实验
3.3.1自由基清除率
溶有DPPH的乙醇溶液极易挥发，需低温冷藏，保存时间不宜过长。该法测定需要考虑诸多因素，不适用于精细测定。
图3回流时间和料液比对含量的作用
如图4所示，当药液浓度较小时，提取液和抗坏血酸对体内自由基的影响较小；药液浓度较大时，自由基大部分被清除，增势缓慢，当药液浓度为达到测定最大值时，黄酮提取液85.66%的自由基遭到破坏，抗坏血酸为90.33%，抗坏血酸对体内自由基的破坏性强于复方总黄酮提取液[23]。
图4DPPH自由基清除率
3.3.2总还原力测定（见图5)
当质量浓度为0.50mg·mL-1时，该复方中黄酮总还原力为0.89Abs，抗坏血酸为1.33Abs，总还原力可反映抗氧化水平，因此该纤体复方的抗氧化性弱于抗坏血酸。
图5总黄酮还原力测定
4、结论
含有黄酮类成分较多的物质为天然的还原剂[24]，许多药物的有效成分均为黄酮类物质。因此本实验对中药复方中的黄酮进行优化采用的方法为乙醇回流法，黄酮类物质极性较大，醇类溶剂有利于黄酮的溶解。
最佳工艺为回流时间2h、回流温度84℃、料液比1∶30mg·mL-1，此时中药复方中总黄酮含量为4.51%[25]。当药液浓度为0.50mg·mL-1，复方中总还原力约0.89Abs，黄酮提取液85.66%的自由基遭到破坏，还原力为抗坏血酸的0.67倍，具有显著的抗氧化能力，为降脂复方在食物、保健品和抗氧化剂等方面开发利用扩大市场。
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主办单位：湖南省药学会,湖南省药学会
出版地方：湖南
专业分类：医学
国际刊号：1672-2981
国内刊号：43-1408/R
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创刊时间：2003年
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