痛经（primarydysmenorrhea）是临床最常见的疾病，多发于生育年龄的女性[1]，痛经在临床上主要分为原发性痛经（PD）和继发性痛经（SD)[2],PD是目前妇科最常见疾病，影响世界上50%的女性，其中10%患者症状严重，是影响妇女正常工作和生活质量的常见原因[3]。目前西医对PD的治疗尚未取得满意的治疗方案，非甾体抗炎类药和口服避孕药由于其严重的不良反应，限制了临床使用，中医药在PD治疗方面有许多行之有效的方法，在痛经症状改善及远期疗效方面有着独特的优势[4]。

益母草为唇形科植物益母草LeonurusjaponicusHoutt.的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经、利水消肿、清热解毒功效，临床上常用于血滞经闭、痛经、经行不畅、水肿、小便不利等病症[5]。本课题组在前期实验[6]中，发现益母草颗粒可以减少寒凝血瘀型痛经模型大鼠的扭体次数，对其具有较好的治疗效果，因此采用网络药理学分析方法进一步阐释益母草治疗寒凝血瘀型痛经大鼠模型的作用机制。

网络药理学是一门运用网络方法分析药物与疾病和靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的药理学分支学科[7]，是一门从系统层面揭示中药对机体调控网络作用的新兴学科。中药是一个多成分、多作用靶点和多作用途径的复杂系统，中药及其复方治疗疾病遵循整体观思想。网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合，符合中医药对疾病本质的认识[8,9]，因此网络药理学为研究传统中药与现代药理学之间的相互关系搭建了桥梁。

本研究在系统查阅国内外相关文献的基础上，构建了益母草成分数据库，采用网络药理学的方法预测与筛选益母草的潜在活性成分和治疗痛经的作用靶点，探讨益母草多成分-多靶点-多通路治疗寒凝血瘀型痛经的作用机制，为益母草的深入开发奠定理论基础。

1、材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠，雌性，体质量140～150g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0002。

1.2 药物与试剂

益母草颗粒（北京同仁堂天然药物唐山有限公司，批号18110212）；缩宫素注射液（批号181026）、苯甲酸雌二醇注射液（批号190116），上海全宇生物科技（驻马店）动物药业有限公司；盐酸肾上腺素注射液（批号1812101），天津金耀药业有限公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒、磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液均购自碧云天生物技术研究所；苯甲基磺酰氟（PMSF）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；前列腺素内过氧化物合酶1(PTGS1）兔单抗购自英国Abcam公司；PTGS2兔多抗购自BBI公司；小鼠单抗β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器

DYY-7C型电泳仪电源、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYCZ-40型电转移槽（北京市六一仪器厂）；-80℃超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）；TS-1型水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；SHZ-82型气浴恒温振荡器（上海汗诺仪器有限公司）；T8-1型磁力搅拌器（江苏省金坛市中大仪器厂）；酶标仪（ThermoFisherScientific公司）；HI650型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

2、方法

2.1 网络药理学分析

2.1.1 益母草化学成分收集及活性成分筛选

以“益母草”为关键词，检索TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库收集益母草现有化学成分数据[9]；根据化学成分的药动学参数（吸收、分布、代谢及排泄，ADME）对其进行活性成分筛选，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18。通过筛选共获得7个潜在的活性成分，具体信息见表1。

2.1.2 活性成分SMILE结构式的查询

针对所筛选益母草活性成分，在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中以所收集活性成分的PubchemCid为检索条件，检索并收集每个活性成分的CanonicalSMILES结构式。

2.1.3 活性成分靶点预测

采用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/）服务器[10]，依次上传益母草活性成分CanonicalSMILES结构式，选择物种为Homosapiens，点击Predicttargets，即可基于已知配体的二维和三维相似性度量精确预测益母草活性分子的靶点，获取与益母草活性成分相关的靶点蛋白。

2.1.4 痛经疾病靶点的获取

在TTD(https://db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank(https://www.drugbank.ca/）、DisGeNET(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）数据库中，以“dysmenorrhea、primarydysmenorrhea”为检索词，收集与痛经相关的疾病靶点，删除重复的靶点，并与预测所得的活性成分靶点进行对比，筛选出益母草治疗原发性痛经的潜在靶点。

2.1.5 蛋白互作网络（PIN）的构建与筛选

蛋白互作（PPI）是机体细胞功能的基础，对调节机体生理、病理状态具有重要作用。PIN是由PPI信息构建的网络，常以网络节点代表蛋白质、以网络连接线代表PPI，以节点大小、颜色，连线长度、粗细代表节点网络的拓扑参数[11]。为了进一步了解益母草靶点和疾病靶点在蛋白水平上协同的作用机制，将映射得到的靶点蛋白通过STRING10.5(https://string-db.org）获取PPI关系。

2.1.6 GO和KEGG富集分析

将获得的益母草治疗痛经的潜在作用靶点通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp,DAVID6.8Oct.2016）输入靶基因名称列表并限定物种为人，设定阈值P<0.05，对益母草治疗痛经潜在活性成分靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，筛选出益母草治疗痛经的重要信号通路。

2.1.7 “活性成分-靶点-通路”网络模型构建与分析

采用cytoscape3.6.0软件构建益母草治疗痛经的“活性成分-靶点-通路”网络模型，网络包括活性成分、靶点或作用通路3类节点（node），并以边（edge）相连，通过构建网络模型研究益母草治疗痛经多成分、多靶点、多通路的作用机制。

2.2 Westernblotting实验验证

2.2.1 模型建立、分组及给药

雌性Wistar大鼠30只随机分为对照组、模型组、益母草颗粒组，复制寒凝血瘀痛经模型[12,13]，造模第3天益母草颗粒组大鼠ig益母草颗粒溶液（5g/kg，相当于临床用量10倍），对照组、模型组大鼠给予等量蒸馏水，连续11d，各组大鼠于末次给药后，ip缩宫素（20U/kg），观察大鼠扭体潜伏时间及30min内扭体反应次数，实验结束后，取大鼠子宫，置-80℃冰箱冻存。

2.2.2 Westernblotting法检测花生四烯酸代谢通路PTGS1、PTGS2蛋白的表达

将少量子宫组织置于2mLEP管中，加入清洗干净的钢珠，加200μL单去污剂裂解液裂（含2μLPMSF、2μL磷酸酶抑制剂），置于自动匀浆机中匀浆，冰上裂解30min，而后于4℃、12000r/min离心15min，取上清，并用BCA法蛋白定量。制备蛋白上样样品，取蛋白样品40μg进行SDS-PAGE电泳，转膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST(0.3%Tris、0.8%NaCl、0.01%聚山梨酯-20、pH7.4）封闭2h，加入一抗4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤5次，每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶50000),37℃摇床孵育2h,TBST洗膜5次，每次5min,ECL化学发光显色，采用IPP软件对相关蛋白表达进行分析。

2.2.3 数据分析

实验数据均采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，各组数据均以表示。所得数据作方差齐性检验后作t检验。

3、结果

3.1 益母草活性成分筛选

通过TCMSP数据库检索到益母草已报道的化学成分共58种，以ADME参数OB≥30%、DL≥0.18筛选后得到益母草草活性成分8种。筛选所得活性成分具体信息见表1。通过Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库收集益母草活性成分的CanonicalSMILES结构式。因查询不到MOL001422(iso-preleoheterin)PubChem＿Cid，未能找到其CanonicalSMILE，故在接下来实验中不予讨论。

3.2 靶点预测与筛选

通过SwissTargetPredaction对益母草筛选所得活性成分进行靶点预测，其中7种成分均与痛经有关，将预测靶点与TTD、DrugBank、DisGeNET数据库所获得与痛经疾病相关的靶点进行映射，筛选得到益母草治疗痛经的潜在靶点22个，具体靶点信息见表2。

3.3 PIN的构建与筛选

将“3.2”项得到的22个交集基因带入STRING进行分析，PIN（图1）包含22个节点，44条边，其中节点表示蛋白，每条边则表示PPI关系，其中平均介度值（degree）为3.82。

表1益母草筛选所得活性成分具体信息

表2益母草治疗痛经相关靶点信息

3.4 GO和KEGG富集分析

对益母草治疗痛经的22个潜在靶点通过DAVID数据库进行GO富集，共得到GO条目71个（P<0.05），其中生物过程（BP）条目46个，细胞组成（CC）条目4个，分子功能（MF）条目21个，生物过程、细胞成分和分子功能分别占61%、11%和28%，见图2。22个靶点主要集中于细胞质膜上，涉及前列腺素生物合成过程的正向调控、雌激素反应、血压调节、RNA聚合酶II启动子的转录起始及类固醇激素介导的信号通路等生物学过程，发挥调节类固醇激素受体活性、酶结合、类固醇结合、前列腺素过氧化物合酶活性2、加压素受体活性等功能作用。

图1益母草靶点和疾病靶点的PIN

KEGG通路富集筛选得到7条信号通路（P<0.05），涉及花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、血清素突触、卵巢类固醇生成、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、化学致癌作用、氮代谢7条信号通路，见表3。

3.5 “活性成分-靶点-通路”网络模型构建与分析

采用Cytoscape3.6.0软件建立“益母草活性成分-疾病靶点-代谢通路”网络模型，如图3所示，共有36个节点（7个活性成分节点、22个靶点节点及7个通路节点）。采用NetworkAanlyzer插件对网络的拓扑参数进行分析，平均相邻节点数（averagenumberofneighbors）为4.278，网络异质性（networkheterogeneity）为0.579，网络密度（networkdensity）为0.122，网络中心度（networkcentralization）为0.203。活性成分、靶点、通路3者存在复杂的网络关系，活性成分通过不同的蛋白靶点在不同的代谢通路中发挥作用，相互协调，符合中药作用的“多成分-多靶点-多通路”特性。从化合物的角度，槲皮素、异鼠李素、山柰酚、鼬瓣花二萜、ZINC04073977、前益母草乙素、花生四烯酸的介数（betweenness）中心性值分别为9、9、11、3、6、8、7；从靶点的角度，度值排名前5位的依次为ALOX5、AKR1C3、CA2、ABCB1、CA3。从信号通路的角度，花生四烯酸代谢信号通路显著性最小，提示益母草可能通过花生四烯酸代谢起到治疗寒凝血瘀型痛经的作用。花生四烯酸代谢通路中涉及6种蛋白，分别为PTGS1、PTGS2、ALOX5、PLAG2A、AKR1C3、CYP2C9。

图2益母草靶标的GO富集分析

表3相关通路信息

图3活性成分-靶点-通路网络

3.6 益母草对寒凝血瘀型痛经模型大鼠扭体反应的影响

寒凝血瘀型痛经模型大鼠扭体次数及潜伏期结果见表4。与对照组比较，在sc苯甲酸雌二醇、ip缩宫素后，模型组大鼠扭体潜伏期显著缩短，扭体次数显著增加（P<0.01）。与模型组比较，益母草可以显著延长大鼠的扭体潜伏期，减少其扭体次数（P<0.05），表明益母草对寒凝血瘀痛经大鼠模型扭体反应改善作用明显，对疼痛症状具有缓解作用。

表4益母草对寒凝血瘀型痛经模型大鼠扭体反应的影响(,n=10)

与对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05

3.7 益母草对花生四烯酸代谢通路PTGS1、PTGS2蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠子宫中PTGS1、PTGS2蛋白表达水平显著降低（P<0.05、0.01）。与模型组比较，经益母草干预后PTGS1、PTGS2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。

图4益母草颗粒对模型大鼠子宫PTGS1、PTGS2蛋白表达的影响(,n=3)

与对照组比较：#P<0.05##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05

4、讨论

中药及复方因其具由多成分、多靶点、多途径协同作用及作用机制不明确等特点，影响其进一步深入研究。而网络药理学是基于药物之间的构效相似性，考虑体内生物分子及靶标的相互作用关系，通过构建“药物成分-靶点”“疾病-靶标”和“成分-靶点-信号通路”网络，能有效预测药物的功效或产生特定功效对应的机制，是目前复方中药研究的新方法[14]，网络药理学为中药及复方作用机制的研究提供了新思路，实现了对中药及复方作用机制整体化、系统化研究，也为中药复方安全性评价及新药的开发奠定了基础[15]。

本研究通过TCMSP数据库，搜集并整理益母草化学成分，通过“ADME原则”筛选出潜在的活性成分，采用SwissTargetPredaction服务器对潜在活性成分的靶点进行预测，并与痛经相关疾病靶点进行比对分析，获得益母草治疗痛经的22个潜在靶点，通过构建“成分-靶点-信号通路”的网络及KEGG通路富集分析，确定了包括花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、血清素突触、卵巢类固醇生成、PPAR信号通路、化学致癌作用、氮代谢7条信号通路。其中，花生四烯酸代谢信号通路的显著性最高，提示益母草可能通过该信号通路发挥治疗寒凝血瘀痛经的作用。其中花生四烯酸信号通路涉及的靶点有PTGS1、PTGS2、ALOX5、PLAG2A、AKR1C3、CYP2C9。

PTGS又叫环氧化酶（COX），是生物体内前列腺素（PG）合成起始步骤的关键酶，是生物活性脂类调节物包括前列腺素、血栓烷素和前列环素等各家族的前体[16]。PTGS可以发挥2种作用，一是环氧化酶作用，将花生四烯酸（AA）环氧化产生前列腺素G2(PGG2）；二是过氧化物酶作用，将PGG2还原为前列腺素H2(PGH2）。PGH2在各种特异性合成酶的作用下产生前列腺素D2(PGD2）、前列腺素E2(PGE2）、前列腺素F2α（PGF2α）等类花生四烯酸类物质[17]。PTGS的代谢产物PGF2α、PGE2目前研究较多，且现代研究表明[18,19,20],PD与子宫内膜PG增多有关，PG增多是PD的主要发病机制。PGF2α可促进子宫平滑肌和螺旋动脉收缩，PGE2则减缓子宫平滑肌的自发活动从而抑制子宫收缩，PGF2α/PGE2异常引起子宫平滑肌痉挛性收缩是PD发生的主要病理生理机制[21]。因此，花生四烯酸信号通路为PD治疗的关键信号通络。本研究通过制备寒凝血瘀型痛经大鼠模型，选用益母草颗粒进行干预，选取花生四烯酸信号通路，对子宫匀浆中关键靶点PTGS1、PTGS2的蛋白表达进行测定。研究结果表明，益母草可使寒凝血瘀型痛经模型大鼠子宫中PTGS1、PTGS2蛋白表达水平升高。

本研究应用网络药理学方法，对益母草的多成分-多靶点与PD之间复杂网络关系进行研究，并初步验证了益母草治疗寒凝血瘀型痛经的基本药理学作用和相关机制，然而益母草治疗寒凝血瘀痛经的具体作用机制仍需大量的体内外实验进行阐明，本研究旨在为进一步深入探讨其作用机制奠定基础。

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基金:国家自然科学基金资助项目:组分配伍四逆汤对甲减肾损伤的保护作用及其作用机制研究(81373546).