溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性肠病,病变范围涉及肠黏膜及黏膜肌层,具有反复发作、迁延不愈的特点。其发病机制是多因素的,涉及遗传易感性,上皮屏障缺陷,失调的免疫应答和环境因素等[1]。作为一种病因复杂同时尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病[2],UC的诊断缺乏金标准,要综合临床症状、病史、内窥镜检查、病理组织学及微生物相关检测进行最终诊断[3],且难治愈、易复发、易于癌变,已被世界卫生组织列为现代难治病。目前治疗UC的4种基本药物:氨基水杨酸盐、类固醇、免疫抑制剂和生物疗法[4]。由于UC的难治愈性,患者需终身服用药物以控制自身肠道炎症反应,长期服用具有肾毒性、库欣综合征、骨髓抑制、癌变率上升等不良反应[5]。目前,西医治疗UC价格昂贵及不良反应明显,尚无有效的根治方法,而中医药治疗UC疗效显著,辨证论治,内外合用,不良反应小,具有简、便、效、廉的独特优势[6]。因此,运用中医药疗法治疗UC或许成为未来一个新的突破。UC属于“久痢”范畴,以腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重为主要临床表现[7]。中医药治疗UC历史悠久,以多途径、多靶点的治疗特点改善肠道炎症,从而达到温和长期的疗效,在治疗UC方面发挥着独特的优势。

葛根芩连汤出自汉代张仲景所著《伤寒论》:“太阳病,桂枝证,医反下之,利遂下止。脉促者,表未解也;喘而汗出,葛根芩连汤主之。”主治太阳表邪内陷所致湿热下利证。该方由葛根、黄芩、黄连、甘草4味药组成,是治疗湿热所致腹泻和痢疾的经典方剂[8],临床上用葛根芩连汤为基础方治疗大肠湿热证UC常获良效[9]。然而,现有关于葛根芩连汤的基础研究较少,且对其作用机制及通路的研究多局限于部分指标,尚不系统全面,难以反映中药方剂多成分、多靶点、多通路的作用特性。另外葛根芩连汤中药成分复杂,目前相关研究无法确定葛根芩连汤中的某一有效成分作用于UC靶点,即研究缺少精确性。网络药理学是系统生物学的重要组成部分,能够建立“成分-药物-靶点-疾病”多重网络关系,具有整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点,与中医药治疗疾病的整体观相吻合[10]。因此,本研究旨在运用网络药理学的研究方法挖掘葛根芩连汤治疗UC的作用机制进行初步探索,为以后的基础研究提供参考依据。

1、材料与方法

1.1葛根芩连汤的化学成分信息获取及收集

使用中药系统药理学分析平台收集葛根、黄芩、黄连、甘草4味药物的化学成分及靶点。TCMSP是基于系统药理学的研究方法的一个整合药物代谢动力学、药物化学和药物-靶标蛋白网络-疾病网络的中药系统药理学数据库和分析平台,是沟通传统中医药研究与现代医学研究的桥梁[11]。通过利用TCMSP平台,设定药物成分口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)筛选出葛根、黄芩、黄连、甘草中具有良好的口服生物利用度和类药性的化合物,即活性成分。

1.2活性成分作用靶点的获取及收集

将整理出的药物活性成分作用的靶点导入Uniprot(https://www.uniprot.org/)得到标准化基因名称,筛选出与人类相关的基因并进行整理,得到人类标准化活性成分作用靶点,并利用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”关系网络。

1.3UC靶点的获取及关键靶点的收集

使用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)获取与UC相关靶点基因。将药物活性成分作用靶点和疾病靶点基因取交集,得到葛根芩连汤治疗UC的关键靶点。

1.4关键靶点蛋白相关作用网络的构建

String数据库是一个能够整合已知和预测大量生物的蛋白质-蛋白质关系的数据库,通过检索可以得到想要的蛋白质与蛋白质之间的相互作用[12]。将葛根芩连汤治疗UC的关键靶点导入String数据库,将研究物种选择为人类,获得蛋白互作关系,将结果以TSV格式导出。所得数据导入Cytoscape软件进行可视化分析,绘制蛋白相互作用网络。设置网络中节点大小和颜色深浅反映Degree值。

1.5关键靶点生物功能注释及通路分析及可视化

将关键靶点基因输入DAVID数据库中进行GO富集分析,选择生物过程(biologicalprocess),分子功能(molecularfunction)和细胞组成(cellularcomponent)3个模块。然后使用Cytoscape中的插件Cluego对关键靶点进行通路分析,选择KEGG,设定P<0.05以确定关键靶点富集通路。

2、结果

2.1葛根芩连汤处方中化学成分的收集及活性成分的筛选

葛根芩连汤组成:葛根、黄芩、黄连、甘草。通过TCMSP数据库检索收集葛根化学成分18个,黄连化学成分48个,黄芩化学成分143个,甘草化学成分280个,最终得到489个化学成分。通过平台自带筛选器限定OB与DL的值,最终得到葛根的潜在活性成分4个,黄芩的潜在活性成分36个,黄连的潜在活性成分14个,甘草的潜在活性成分92个,整合去重最终得到138个潜在活性成分,通过TCMSP寻找到活性成分作用靶点为2394个。使用Uniprot将活性成分的作用靶点名称导入,找出其与人类相关的基因并进行合并去重,最终获得256个基因。

2.2“活性成分-靶点”网络构建分析

将138个活性成分,256个靶点基因导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化(见图1)。其中按度值排名前20的有quercetin,PTGS2,CALM1,HSP90AB1,AR,NOS2,ESR1,PRSS1,PPARG,ESR2,CDK2,SCN5A,PAL_GLEAN10007028,NCOA2,F10,GSK3B,CHEK1,CCNA2,MAPK14,PTGS1,表明以上成分及基因是葛根芩连汤治疗UC的重要成分及重要靶点基因,对治疗UC有重要意义。

2.3葛根芩连汤治疗UC的关键靶点收集

通过GeneCards平台收集UC相关靶点基因,搜索到关于UC相关靶点3870个。按score分数排序,收集数值大于15的靶点,共96个。将疾病靶点与活性成分作用靶点取交集后最终获得27个关键靶点基因(见图2)。关键靶点具体为:AKT1,BAX,CCND1,CDKN1A,CRP,CXCL8,EGF,ERBB2,ICAM1,IFNG,白细胞介素(interleukin,IL)-10,IL-1B,IL-2,IL-4,MMP1,MMP9,MPO,NOS2,PPARG,PTGS1,PTGS2,STAT1,STAT3,TGFB1,TNF,TP53,VEGFA。

图1“活性成分-靶点”网络图

图2疾病靶点基因与药物活性成分靶点基因的匹配

2.4关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将27个关键靶点基因导入String数据库获取蛋白相互作用关系,再将获得数据导入Cytoscape软件绘制蛋白关系网络(见图3)。该网络图共包括27个节点,86条边。将结果以TSV格式导出,再将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化,绘制蛋白相互作用网络(见图4),以Degree数值反映节点的大小,其中度值越大,节点越大。度值排名前8位的有STAT3,TNF,CXCL8,IL1B,VEGFA,TP53,IL-10,AKT1,表明这些靶点在葛根芩连汤治疗UC中有重大的作用。

2.5关键靶点的GO分析

对关键靶点基因进行GO富集分析,根据FDR筛选得到22个条目(见图5)。靶点关联的生物过程主要有在对宿主中共生体生长的负调控、调控生长因子及细胞因子活性RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调节作用、同种型转换为IgG同种型的正调节、MHCII类生物合成过程的正调节、趋化因子生物合成过程的正调节、蛋白质磷酸化及寡聚化的正调节、细胞周期停滞、过氧化物酶活性的调节、炎症反应、外源性凋亡信号传导途径、基因表达的负调控、对细菌的防御反应、细胞色素c从线粒体释放的正调节、胰岛素分泌的调节等。

图3关键靶点基因相互作用网络

图4葛根芩连汤-UC蛋白相互作用网络

2.6KEGG通路分析

本研究采用Cytoscape中的插件ClueGO来对关键靶点进行通路富集分析。如图6、图7所示,关键靶点主要集中在松弛素信号通路,丝裂原活化蛋白信号通路,叉头状转录因子O亚家族蛋白信号通路,磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号通路,Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路,T细胞受体信号通路,Toll样受体信号通路,AGE-RAGE信号通路,核因子kappaB信号通路,C型凝集素受体信号通路,IL-17信号通路,肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)信号通路。这些途径在免疫、炎症等方面发挥着重要的作用。

图5关键靶点GO富集分析

图6葛根芩连汤治疗UC信号通路富集分析网络图

图7葛根芩连汤活性成分关键靶点的KEGG代谢通路富集分析

3、讨论

近年来,UC的发病率在世界范围内有所增加,特别是在发展中国家[13]。UC发病机制尚不明确,采用免疫抑制改善炎症反应的药物治疗UC虽有短暂良好的效果,但长期服用不良反应大,患者耐受性差。本文将目光聚集于《伤寒论》经典名方之葛根芩连汤,通过网络药理学数据挖掘,为葛根芩连汤治疗UC进行较全面系统的预测,为日后基础研究与临床应用提供一定的思路。

通过网络药理学方法对葛根芩连汤进行研究,最终找到了138个潜在活性成分,预测了256个潜在靶点。在“活性成分-靶点”网络图中槲皮素、β-谷缁醇、黄连碱、小檗碱等活性成分可作用于多个靶点,这些成分可能是葛根芩连汤治疗UC的主要活性成分。通过GeneCards平台收集UC相关靶点基因,与活性成分作用靶点取交集后最终获得27个关键靶点基因。其中STAT3、TNF、CXCL8、IL-1β、VEGFA、TP53、IL-10、AKT1这8个关键靶点在治疗UC中具有重要的作用,主要表现在:①STAT3:通过抑制IL-6/Jak/STAT3信号通路,抑制STAT3活化,减少T细胞增殖,从而减轻肠道炎症[14]。②TNF、IL-1β、IL-10:TNF-α和IL-1β是UC发病机制中重要的促炎介质,促炎细胞因子IL-lβ可上调免疫因子并促进炎症活性;促炎细胞因子TNF-α可使内皮细胞黏附分子水平升高并诱导中性粒细胞聚集,而IL-10通过抑制激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和T细胞改善炎症[15]。③CXCL8:CXCL8是一种炎性趋化因子,在炎症反应中CXCL8/IL-8升高,并且优先结合CXC趋化因子家族的G蛋白偶联受体(GPCR)CXCR1/2以启动下游炎症信号[16]。④VEGFA:血管内皮生长因子A有两种亚型VEGFA121和VEGFA165,发挥抗血管生成和促血管生成的相反作用,共同调节血管内皮细胞增殖和血管形成。VEGFR2的不同磷酸化位点的激活导致VEGFA121和VEGFA165对血管生成发挥相反的作用,可能是UC的潜在发病机理和UC治疗的潜在靶标[17]。⑤TP53:是一种关键的肿瘤抑制基因,其表达与UC癌变转归有着密切的联系[18]。⑥AKT1:SUMO化参与UC的上皮信号传导。在疾病发作期,由于单独的E2SUMO缀合酶Ubc9的下调,SUMO化和非SUMO化蛋白质失去平衡。而AKT1作为主信号调节因子可通过激活NFκB信号传导途径加重病情,导致伤口愈合受损[19]。

从GO富集结果来看,关键靶点主要通过对宿主中共生体生长的负调控、调控生长因子及细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调节作用、同种型转换为IgG同种型的正调节、MHCII类生物合成过程的正调节、趋化因子生物合成过程的正调节、蛋白质磷酸化及寡聚化的正调节、细胞周期停滞、调节过氧化物酶活性、炎症反应、外源性凋亡信号传导途径、基因表达的负调控、对细菌的防御反应、细胞色素c从线粒体释放的正调节、调节胰岛素分泌等生物过程,在细胞外泌体,质膜外侧,细胞核中发挥作用。

KEGG通路分析结果显示,可以发现预测的关键靶点主要集中在松弛素(Relaxin)信号通路,丝裂原活化蛋白信号通路,叉头状转录因子O亚家族蛋白信号通路,磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号通路,Janus激酶/信号转导与转录激活因子(Jak/STAT)信号通路,T细胞受体信号通路,Toll样受体信号通路,AGE-RAGE信号通路,核因子kappaB信号通路,C型凝集素受体信号通路,IL-17信号通路,TNF信号通路。预测的葛根芩连汤治疗UCToll样受体、NF-κB信号通路与有关研究报道一致[20,21,22]。本研究预测出的结果具有可靠性,还表现在:①丝裂原活化蛋白信号通路:是与UC发病机制密切相关的信号通路,其活化被认为是导致UC细胞因子和炎症介质释放的主要因素之一[23]。②磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号通路:PI3K/Akt信号转导途径参与促炎细胞因子如TNF-α的调节和释放,并在UC的发生和发展中起重要作用[24]。③IL-17信号通路:IL-17A具有强烈的致炎性,可增加细胞的通透性,促进其他前炎症因子和趋化因子的产生,在UC发病机制中发挥着重要的致炎作用[25]。④肿瘤坏死因子信号通路:通过结合TNFR1或TNFR2触发各种细胞内信号途径,包括在细胞凋亡的情况下激活MAPK,转录因子或半胱天冬酶。作为最重要的促炎细胞因子之一,TNF-α参与血管扩张和水肿形成,白细胞通过黏附分子的表达与上皮细胞黏附;同时能够调节血液凝固,导致炎症部位的氧化应激[26]。这些通路都与UC炎症发生发展密切相关,可能是葛根芩连汤治疗UC的重要通路,有待后期的实验验证。

综上所述,使用网络药理学对葛根芩连汤治疗UC的关键靶点及其相关信号通路进行预测,揭示葛根芩连汤可能通过影响NF-κB、IL-17、Toll样受体、MAPK、PI3K-Akt、Jak/STAT、TNF等信号通路,进而调节炎症反应、细胞增殖与凋亡、过氧化物酶活性、趋化因子的合成等,从而发挥其治疗UC的作用,同时也为阐明葛根芩连汤对治疗UC的作用机制提供一定的科学依据。当然,本研究还存在一些缺陷,基于数据挖掘的网络药理学具有时效性,如数据库中查询不到葛根芩连汤中部分药物主要成分及对应靶点,以及葛根芩连汤进入人体被吸收利用代谢产物未知。为了确切了解葛根芩连汤治疗UC的复杂过程和作用机制,仍需要更进一步的实验研究加以论证。

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