帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）也称震颤麻痹，是以运动障碍为主的神经系统退行性病变，中老年人多发。临床以静止震颤、运动迟缓、肌张力增高及姿势平衡障碍为主要特征。该病起病隐匿，进行性加重，目前尚无根治性治疗方法，临床多以减轻患者临床症状及改善生活质量为主要手段[1]。长期服用西药疗效会降低，药效不稳定，且不良反应大。近年来，中医药对该病的病因病机及临床治疗作了进一步研究，临床治疗取得较好效果，还可减少左旋多巴的用量，从而减轻其带来的不良反应[2]。天麻钩藤饮始载于胡光慈《杂病证治新义》，属于平肝降逆之剂，临床发现以天麻钩藤饮加减的方剂对PD有很好的疗效[3]，且君药天麻、钩藤在中药治疗PD的大数据分析中均位列前五[4]，但对于其治疗PD的具体作用机制仍知之甚少。本研究采用网络药理学方法对天麻-钩藤药对治疗PD的有效成分、关键靶点以及作用通路进行分析，以期为今后分子生物学实验验证提供思路。

1、方法

1.1天麻-钩藤药对所含化学成分以及作用靶点的提取

TCMSP、TCMID、ETCM以及NPASS均为广泛使用的中药药理学数据库。从TCMSP、TCMID、ETCM以及NPASS数据库中提取天麻-钩藤药对中的化学成分。TCMSP数据库没有收录中药天麻，因此天麻的化学成分需从TCMID、ETCM以及NPASS检索，鉴于不同数据库中化学成分名称可能不同，因此将检索得到的化学成分根据其PubChemCID和CAS匹配到TCMSP，找到该化学成分并获取其作用靶点；钩藤的化学成分与其作用靶点均可从TCMSP检索，并将上述检索得到的化学成分根据ADME参数筛选（OB≥30%,DL≥0.18）。

1.2PD疾病基因的获取

DisGeNET是目前涵盖人类疾病基因最丰富的数据库之一，根据PD标准名称“ParkinsonDisease”检索，研究疾病-基因相关关系，挖掘PD相关疾病基因。

1.3天麻-钩藤药对靶点基因与PD疾病基因的匹配及其网络构建

从国际知名的蛋白质数据库TCMSP检索得到的天麻-钩藤药对靶点蛋白在Uniprot中均有其对应的GeneSymbol。将以上获得的药物靶点GeneSymbol与在DisGeNET挖掘得到的PD相关GeneSymbol进行匹配，得到天麻-钩藤药对治疗PD的作用靶点。运用Cytoscape3.7.2软件构建天麻-钩藤药对的化学成分与其治疗PD相关靶点基因的可视化网络图。

1.4天麻-钩藤药对治疗PD靶点蛋白互作网络的构建

将匹配后的天麻-钩藤药对治疗PD的作用靶点上传至STRING11.0在线数据库，限定物种为人类（Homosapiens），设置为隐藏离散点。过滤得到的蛋白互作关系均有数据库、实验、基因预测等证据的支持。

1.5天麻-钩藤药对治疗PD靶点蛋白的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用R语言对作用靶点进行GO功能富集分析。之后使用Cytoscape插件ClueGo对KEGG通路富集分析进行筛选，探讨其治疗PD的作用通路并进一步对富集信号通路进行分析，获得各通路相关网络图，并根据重要程度绘制信号通路占比饼状图。KEGG数据库作为整合了基因、酶、化合物及代谢网络信息的综合性数据库，在生物信息学研究中提供了非常重要的平台通路富集分析[5]。

图1药物-疾病维恩图

2、结果

2.1天麻-钩藤药对有效成分-靶点-疾病网络图

从TCMSP、TCMID、ETCM以及NPASS中筛选出天麻和钩藤药物化学成分共64种。将天麻与钩藤的成分匹配到TCMSP中并挖掘其作用靶点，汇总并去除重复后，从Uniprot数据库获取其对应的GeneSymbol，得到246个Genesymbol，即天麻-钩藤药对作用于246个不同的靶点。

通过DisGeNET数据库检索“Parkinsondisease”，挖掘到PD相关疾病相关基因1063个。将疾病相关基因与药物靶点基因的GeneSymbol相匹配，得到天麻-钩藤药对治疗PD的作用靶点共81个，即药物与疾病靶点的交集（见图1）。并根据作用靶点进一步筛选出有效化学成分58种。

将以上数据输入Cytoscape3.7.2软件，以节点（Node）代表成分和靶点；以边（Edge）表示其相互作用，构建的天麻-钩藤化学成分与其治疗PD相关靶点基因的可视化网络图如图2。网络图根据天麻-钩藤药对对PD有治疗作用的81个靶点再次筛选化学成分，排除对81个靶点均无作用的化学成分，即排除对PD无治疗作用的化学成分。经过筛选后的58种有效成分均与治疗PD有关。

2.2绘制蛋白互作网络图并筛选关键靶点

通过STRING11.0在线数据库对天麻-钩藤药对治疗PD的81个作用靶点进行分析，获取相应的蛋白相互作用信息，得到包含81个靶点的该药对治疗PD靶点的蛋白互作网络图（见图3），并根据分析结果，筛选出count值排名前30位的天麻-钩藤药对治疗PD的关键靶点（见图4）。

图2有效成分-靶点-疾病网络图

2.3作用靶点的GO功能富集分析

天麻-钩藤药对治疗PD的81个作用靶点的GO功能富集分析结果见图5a与图5b，作用靶点基因的GO功能主要涉及到核受体运动、转录因子活性、氨根离子结合、儿茶酚胺结合、多巴胺结合、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、血红素结合、RNA聚合酶Ⅱ活性、氧化还原酶活性、细胞因子活性等。

2.4作用靶点的KEGG通路富集分析

利用Cytoscape对天麻-钩藤药对治疗PD的81个靶点基因进行KEGG通路富集分析，并通过ClueGO以P<0.05进行筛选。结果显示，81个靶点基因涉及到的91条信号通路可分为17类（见图6a），包括细胞凋亡相关通路、多巴胺能神经元相关通路、病毒感染相关通路、催乳素相关通路、雌激素相关通路、肿瘤相关通路等。分析数据发现，细胞凋亡相关通路所占比例最大（42.93%），不同信号通路之间存在复杂的联系（见图6b）。

图3天麻-钩藤药对的蛋白互作网络图

图4天麻-钩藤药对治疗帕金森病的关键靶点（排名前30位者）

3、讨论

根据PD症状可将其归于中医学颤证的范畴。对颤证的认识最早可追溯到《黄帝内经》。《素问·至真要大论》指出：“诸风掉眩，皆属于肝……诸暴强直，皆属于风。”明代孙一奎《赤水玄珠》中指出：“颤振者，人病手足摇动，如抖擞之状，筋脉约束不住，而莫能任持，风之象也……此病壮年鲜有，中年以后乃有之，老年尤多。夫老年阴血不足，极为难治。”认为该病系年老阴血不足，肝风内动而致。因此临床常采取平肝息风、祛风通络之法。

天麻、钩藤配伍，可上溯至元代孙允贤《医方大成》，二药均为治疗肝风内动、惊痫抽搐所常用。钩藤味甘性凉，入肝、心经，既能平肝风，清泄肝热，又能息风定惊擅治肝热风动之证；天麻味甘性平，入肝经，养液平肝，息风潜阳，亦善治风，主治“风虚眩晕头痛”、风痰上扰所致诸证。二药配伍，相得益彰，以增清热平肝、息风止痉之功效[6]。诸多以天麻-钩藤药对为基础的方剂对PD的运动迟缓、静止性震颤、肌强直、姿势不稳以及睡眠障碍均有改善作用；还可减少左旋多巴的用量，从而减轻其带来的不良反应[7]。孙忠义等[4]运用中医传承辅助系统对108首治疗PD方剂进行分析，发现使用频次极高的药物有白芍、天麻、熟地黄、当归、钩藤等，其中天麻-钩藤组合是目前临床治疗PD最常使用的药对之一，但其发挥作用的关键成分、作用靶点以及其生物学机制并未完全阐明。为明确其机制，本研究以网络药理学为基础，纳入了本文涉及数据库中当前已知的化学成分、作用靶点、PD相关基因，以完成后续的网络分析。

图5aGO功能富集分析柱状图

图5bGO功能富集分析气泡图

图6a信号通路饼状图

图6b信号通路网络图

研究发现，天麻的有效化学成分主要包括香草酸、琥珀酸在调节血管内皮细胞功能、调控细胞代谢、抑制慢性神经炎症中有重要作用[8,9]。钩藤的有效化学成分包括山柰酚等，对抑制神经细胞的凋亡、神经功能的改善以及神经再生具有重要作用[10]；而槲皮素在网络图（图2）中涉及靶点最多，作用广泛，槲皮素可以增强脑组织中抗氧化酶活力，减少自由基对神经细胞的损伤[11]，还具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种作用。

天麻-钩藤药对有效靶点进行STRING分析（图3），关键靶点丝氨基酸/苏氨基酸激酶1(AKT1）、白细胞介素-6(IL-6）、胱冬酶3(CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8）、雌激素受体1(ESR1）、表皮细胞生长因子（EGF）等与PD的治疗最为密切。通过Uniprot数据库得知，CASP3与CASP8是细胞凋亡相关基因，且CASP3介导的多巴胺能神经元凋亡可能在PD的发病机制中发挥重要作用[12]。MAPK8参与细胞增殖、分化、迁移、转化和程序性细胞死亡等过程，但其与PD的相关研究仍需完善。IL-6与神经胶质细胞的激活、神经细胞轴突生长有关[13,14]。ESR1的靶点蛋白为雌激素受体，ESR1的激活介导了RNF146表达，以保护多巴胺能神经元[15]。AKT1基因的变异与帕金森病风险相关[16]。本研究预测的这些关键靶点可以作为今后PD新药物研发的研究方向之一。

在KEGG富集分析饼状图中，细胞凋亡相关信号通路所占比例最高，从网络图进一步分析发现细胞凋亡相关通路与多巴胺能神经突触、EB病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、催乳素信号通路、雌激素信号通路等不同类型的信号通路均有直接联系，说明细胞凋亡相关信号通路在天麻-钩藤药对治疗PD的过程中发挥了重要的作用，这与目前最受重视的帕金森发病机制之一———细胞凋亡学说相一致[17]。P53信号通路是与细胞凋亡有关的直接信号通路，相关研究证实，P53基因在6-羟基多巴胺氧化应激作用的诱导下，在Ser-15位点发生磷酸化，从而激活下游促凋亡基因Puma的转录，表明神经毒素暴露后P53信号通路的激活是介导多巴胺能神经元凋亡的启动因子[18]。而Th17细胞介导的IL-17信号通路同样能诱导多巴胺能神经元凋亡，Th17细胞分泌的IL-17与其受体结合后作用于多巴胺能神经元，引起核转录因子NF-κB活化以及随后的神经退行性变[19]，作用机制见图7。

除细胞凋亡相关信号通路之外，自噬、多巴胺能神经突触、催乳素信号通路、动脉粥样硬化、EB病毒感染等类型的相关通路也存在显著的富集，说明天麻-钩藤药对还通过调控细胞凋亡之外的其他类型通路，实现对PD的治疗。通过对其他信号通路的研究发现：(1)PD与自噬相关：α-异核蛋白（α-synuclein）在PD的发生发展中起关键作用，该毒性蛋白聚集会导致神经元凋亡，而自噬却能及时降解细胞内的毒性蛋白从而保护细胞[20]。另一方面自噬过度激活会导致细胞启动Ⅱ型程序性死亡[21]。因此，保持适度的自噬水平在治疗PD中尤为重要。(2)PD发病机制可能与炎症反应相关：EB病毒、人类巨细胞病毒在病原学上证实与脑炎相关[22]，病毒性脑炎的发病机制如细胞凋亡、氧化应激损伤等[23]与PD十分相似。且现已在实验室利用乙型脑炎病毒成功建立了PD大鼠模型[24]，临床上也有少量关于病毒性脑炎出现PD症状的报道[25]。值得注意的是卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染相关通路虽然高度富集，但其疱疹性病毒HHV-8与已知的导致病毒性脑炎的疱疹性病毒（HSV-1,HSV-2)[23]不同，该通路与PD的相关性仍需进一步研究。(3)流行病学研究显示，炎症反应可使PD的发病率明显升高[26]。动脉粥样硬化（AS）与炎症过程的基本特征有着相似的病理变化[27]，且近年研究发现，外周器官炎症反应对PD的发生发展也起到一定的作用[28]，因此除了中枢神经系统炎症反应在本病发病机制起重要作用外，血管内皮的炎症反应对本病也有一定的促进作用[29]。(4)根据信号通路饼状图（图6a）中癌症相关通路占比16.3%，我们预测PD与癌症在发病机制上存在相关性。PD是神经细胞死亡，而癌症是细胞不受控制地增殖，已有流行病学研究表明PD与癌症之间存在负相关关系[30]。另有研究表明PD与癌症的联系主要体现在两个方面，一方面二者共享部分基因和信号通路，另一方面是具有相同的病理生理状态如线粒体功能障碍、氧化应激、DNA损伤等，这两方面被异常调节到不同方向从而发展为不同结果[31]。因此有学者推测PD的某些生物因素可能对癌症起保护作用[30]。(5)血浆催乳素水平降低可能是PD患者痴呆加重的原因，临床治疗中可通过调控血浆中催乳素水平，改善患者认知程度[32,33]。(6)雌激素在维持黑质多巴胺神经系统完整性中具有重要地位，对PD患者的运动症状和记忆力有改善作用[34]。(7)在富集度较低的通路中，发现了胰岛素相关通路。越来越多的研究显示，在PD患者和模型动物的脑中出现胰岛素抵抗，胰岛素信号通路异常引起的线粒体功能障碍、神经炎症等都与PD的发病机制密切相关[35]。相关临床试验证实，胰岛素能够有效延缓PD合并糖尿病患者认知功能的下降[36]。因此，胰岛素治疗应考虑作为改善本病症状的一种方案。

图7白细胞介素-17(IL-17）信号通路诱导多巴胺能神经元凋亡过程图

以上KEGG富集分析的结果说明，天麻-钩藤药对主要通过细胞凋亡信号通路实现对PD的治疗作用，此外还通过自噬相关通路、催乳素信号通路、雌激素信号通路、胰岛素相关通路等共同发挥作用。雌激素、胰岛素、AS药物等对PD患者的临床症状具有改善作用[29]，提示我们对于PD合并糖尿病、AS或服用雌激素的患者，应注意优化治疗方案，多种药物联用，有利于减轻左旋多巴用量，并从多种机制入手改善PD症状。进一步研究发现PD与AS、病毒性脑炎、糖尿病在发病机制以及病因学上存在密切的关系。此外，对于高度富集但其相关机制与PD仍未明确的通路来说，对今后PD发病机制以及病因学方面的研究具有参考价值。

天麻-钩藤药对在临床治疗PD应用十分广泛，中药成分具有复杂的协同关系，通过多靶点、多途径发挥治疗作用，这与中医的整体观念不谋而合。本研究采用网络药理学的方法探究其“成分-靶点-疾病”的复杂网络，通过KEGG通路富集分析挖掘出天麻-钩藤药对治疗PD的具体机制，为今后的基础和临床研究提供了思路，也为PD药物的研发提供了参考。

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