阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease,AD）是一种进行性神经退行性疾病，记忆力下降是其最常见的症状，涉及多个认知领域的损害[1]。阿尔茨海默病的发病机制非常复杂，目前相关假说包括胆碱能假说、淀粉样β蛋白（Aβ）假说、Tau蛋白假说、兴奋性毒性假说、氧化应激假说、载脂蛋白E(ApoE）假说、CREB信号通路、3型糖尿病假说等[2]。迄今为止美国食品与药品管理局仅批准了5种药物用于阿尔茨海默病的治疗，包括4种胆碱酯酶抑制剂（他克林，多奈哌齐，卡巴拉汀，加兰他敏）和一种N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂（美金刚）[3]。但以上药物只能改善阿尔茨海默病的临床症状，不能阻止或逆转疾病的进展[4]，仍需要探索预防及延缓其发病、减缓其进展或改善阿尔茨海默病症状的药物。

复方苁蓉益智胶囊是王永炎院士研发的复方中成药，用于轻、中度血管性痴呆肝肾亏虚兼痰瘀阻络证，现已广泛应用于临床[5]。复方苁蓉益智胶囊由肉苁蓉、制首乌、荷叶、漏芦、地龙5味中药组成，具有益智养肝，活血化浊，健脑增智的功效。将复方苁蓉益智胶囊用于阿尔茨海默病所致的认知功能障碍也具有一定的疗效[6]。

网络药理学是一门新兴的药理学分支学科，通过检索网络数据库，构建“药物-靶点-疾病”网络关系，从整体层次来预测药物治疗疾病的作用机制[7,8]。网络药理学与中医药的整体观念及中药方剂的多组分、多靶点有许多相似之处，为研究中药复方的作用机制和药效物质基础提供了全新的视角和解决方案。现用网络药理学的方法，挖掘复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在作用机制，以期为其临床应用提供更多依据。

1、材料与方法

1.1数据库与软件

中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)[9];BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)[10];TCMID数据库（http：//119.3.41.228:8000/tcmid）/[11]；化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)[12];PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissADME数据库（http：//www.swissadme.ch/）[13];SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[14];UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）[15];GeneCards数据库（https：//www.genecards.org)[16]、OMIM数据库（http：//www.omim.org)[17]、TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[18];Cytoscape软件（Version3.7.1);String数据库（https：//string-db.org）/；微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）；Metascape平台（https：//metascape.org/）；ImageGP平台（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）。

1.2复方苁蓉益智胶囊化学成分收集及活性成分的筛选

从TCMSP、BATMAN-TCM数据库、TCMID数据库、化学专业数据库中收集肉苁蓉、荷叶、漏芦、何首乌、地龙5味中药的化学成分，并从中国知网、Pubmed数据库搜索文献加以补充。

药物的药代动力学特性包括吸收、分布、代谢和排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion,ADME），是现代研发药物的重要参数[19]。筛选具有良好ADME特性的活性成分对于开发抗阿尔茨海默病药物至关重要。

将化合物输入PubChem数据库搜索，得到标准SMILES并导入SwissADME数据库。评估2个与ADME相关的参数，GI(Gastrointestinal）吸收和Lipinski，以筛选出潜在的活性成分。筛选标准为：a.GI吸收为“High”;b.Lipinski为“Yes,0violation”。复方苁蓉益智胶囊为口服给药，主要通过胃肠道吸收，因此将GIabsorption为“High”作为筛选标准一。Lipinski“5规则”是根据化合物的理化性质判断类药性的一种方法，广泛应用于药物设计和药物筛选[20]，将此规则作为筛选标准二。

1.3复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的靶点预测

将ADME筛选后的化合物的二维结构文件（.sdf）导入SwissTargetPrediction数据库，设置属性为“homosapiens”，选择Probability>0的预测靶点。使用UniProt数据库对目标靶点名称进行统一标准化，得到基因名（genesymbol）。删除重复值后，最终得到活性成分的靶点。

以“Alzheimer”“Alzheimerdisease”为关键词，挖掘GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库中潜在靶点，并在已发表的文献中检索美国FDA批准用于阿尔茨海默病的治疗的5种药物（他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚）涉及的靶点。在Genecards数据库中，relevancescore值越高代表该靶点与疾病联系密切，设定relevancescore>10的目标靶点为阿尔茨海默病的潜在靶点[21]。合并4个疾病数据库以及文献搜索获得的靶点后，将所有靶点进入uniprot数据库统一为基因名（genesymbol），删除重复值得到阿尔茨海默病的靶点。用韦恩图取活性成分靶点和阿尔茨海默病疾病靶点的交集，得到复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点。

1.4潜在靶点蛋白质-蛋白质互作（protein-proteininteraction,PPI）网络的构建

将上述得到的复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点输入到String数据库中，限定物种为人，最小相互作用阈值设置为“highestconfidence”(>0.9），获得PPI网络，并用cytoscape3.7.1内置的NetworkAnalyzer功能分析网络。利用Metascape平台对PPI网络进一步分析，应用分子复杂检测（MCODE）算法识别密集连接的网络模块。

1.5潜在靶点geneontology(GO）分析与kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(KEGG）通路富集分析

将复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病Metascape<0.01的潜在靶点录入Metascape平台，设置P<0.01，进行GO分析和KEGG通路分析，并对结果进行富集。保存数据结果并利用ImageGP平台对数据进行可视化。

1.6单味药-关键成分-潜在靶点-通路网络的构建

根据活性成分靶点和疾病靶点的交集靶点，对所有活性成分进行进一步筛选，得到与潜在靶点有关联的化合物，称为“关键成分”。将单味药、关键成分、潜在靶点及KEGG通路富集分析的前20个集合进行数据处理，导入Cytoscape3.7.1软件，构建单味药-关键成分-潜在靶点-通路网络，再利用Cytoscape3.7.1内置的NetworkAnalyzer功能分析网络拓扑参数，获得度（degree）、中介度（betweennesscentrality）、紧密度（Closenesss）等参数，并根据这些参数判断药物作用的核心靶点。

2、结果

2.1复方苁蓉益智胶囊化学成分及活性成分

从数据库及文献中共收集到肉苁蓉化学成分207个、荷叶117个、漏芦59个、地龙28个、何首乌25个。经过SwissADME筛选后，符合筛选标准的成分中，肉苁蓉64个、荷叶44个、漏芦19个、地龙20个、何首乌29个。其中，肉苁蓉与地龙有3个共有成分，肉苁蓉与漏芦有1个共有成分。

2.2复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点

得到活性成分靶点942个，阿尔茨海默病疾病靶点1543个。将活性成分靶点与阿尔茨海默病靶点取交集，得到207个复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点，见图1。

图1复方苁蓉益智胶囊活性成分靶点-阿尔茨海默病（AD）靶点韦恩图

2.3潜在靶点PPI网络分析

将207个复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点导入String数据库中，得到PPI网络，隐藏31个网络中无连接的节点，见图2。度表示连接到该节点的边的个数，平均局部聚类系数表示节点的聚集程度。该网络包含176个节点，752条边，平均节点度值为7.27，平均局部聚类系数为0.49。说明每个靶点平均有7.27个靶点与之相连，且网络中各个靶点之间的关联性较强。利用Cytoscape3.7.1内置的NetworkAnalyzer功能分析网络，度值较大的靶点是APP、MAPK1、MAPK3，分别为51、32、30。

由于网络及其复杂，可通过识别子网络或者模块（module）来分析，以显示特定的拓扑特征和功能特性。PPI模块代表一组参与特定功能的蛋白质，如构成蛋白质复合体、参与代谢途径或信号转导系统[22]，可认为同个module之内的蛋白质相互作用更加紧密。图3利用Metascape平台对PPI网络进行分析，应用分子复杂检测（MCODE）算法识别PPI网络内的模块。对每个模块进行通路和过程富集分析，对其进行功能进行描述。根据P值，保留3个最佳评分项描述相应模块的功能，见表1。

图2复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病潜在靶点相互作用网络

图3复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的PPI网络模块

表1PPI网络模块功能

2.4潜在靶点GO分析与KEGG通路富集分析

应用Metascape数据平台对复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在靶点进行GO分析与KEGG通路富集分析，选择每个富集结果的前20条，见图4、5。潜在靶点涉及的生物过程包括跨突触信号、神经活性配体-受体相互作用、神经递质水平调控等，涉及的分子功能包括神经递质受体活性、突触后神经递质活性、乙酰胆碱受体活性、tau蛋白结合等，相关的细胞成分包括突触后、突触前、突触小泡、多巴胺能突触、胆碱能突触等，参与的通路包括神经活性配体-受体相互作用、阿尔茨海默病、5-羟色胺能突触、cAMP信号通路、多巴胺能突触、胰岛素抵抗、谷氨酸能突触、胆碱能突触等。

2.5单味药-关键成分-潜在靶点-通路网络

根据活性成分靶点和疾病靶点的207个交集靶点，对所有活性成分进行筛选，得到与潜在靶点有关联的化合物，即关键成分146个，每味中药所含关键成份比例见图6，每味中药所含潜在靶点比例见图7。利用Cytoscape3.7.1建立单味药-关键成分-潜在靶点-通路网络，见图8，用内置的NetworkAnalyzer功能分析网络拓扑参数。结果146个关键成分中有98个度值大于5，占约67%，提示大部分关键成分通过作用于多个靶点发挥药效，体现了中药多靶点的特点。介度表示节点出现在其他节点间最短路径中的比例，介度越高，代表在保持网络紧密连接性中节点越重要。紧密度衡量节点接近网络中心的程度，节点到达各个节点的距离之和越短，紧密度越高，相应的节点更接近网络的中心。网络中热嗪碱（rhazine）、荷叶碱（nuciferine）、亚美罂粟碱（armepavine）、O-去甲基荷叶碱（O-nornuciferine）、北美鹅掌楸尼定碱（lirinidine）的度、介度、紧密度均较高，见表2。潜在靶点ESR2、ESR1、EGFR、DRD2、ACHE在网络中的度、介度、紧密度较高，表明这些靶点可能是复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的主要靶点，SLC6A4、HTR2A、MAOA、HTR2C、GSK3B也是相对重要的靶点，见表3。

图5复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病潜在靶点KEGG通路富集分析前20项

图6复方苁蓉益智胶囊5味中药关键成分比例

图7复方苁蓉益智胶囊5味中药潜在靶点比例

图8复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的药物-关键成分-靶点-通路网络图

表2复方苁蓉益智胶囊主要活性成分网络节点参数

表3复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病主要靶点网络节点参数

3、讨论

作为临床实践中最重要的补充和替代疗法之一，中医药在治疗各种复杂疾病，特别是慢性和非传染性疾病方面具有巨大的潜力[23]。复方苁蓉益智胶囊用于阿尔茨海默病[24]及血管性痴呆[5]、脑白质疏松认知障碍[25]、帕金森性痴呆[26]等认知障碍的治疗，具有与西药协同增效的优势，体现了中西医联合治疗的优越性。

本研究对复方苁蓉胶囊的关键成分和潜在靶点在5味中药中的分布比例分析提示，复方中肉苁蓉和荷叶在复方中占主要地位。而从配伍原则来看，本复方以肉苁蓉和何首乌合用为君药。肉苁蓉味甘、咸，性温，入肾、大肠经，《本草经疏》云“肉苁蓉，滋肾补精之要药”。何首乌味甘、苦、涩，性微温，入肝、肾经，《玉楸药解》曰“滋益肝血”。二药合用，共奏补肾益精养血之功，此乃治病之肾虚之本。网络药理学的视角和中医理论在复方苁蓉益智胶囊方剂配伍层面具有统一性。

从网络中筛选出了几个重要成分。热嗪碱是一种生物碱[27]，对热嗪碱的研究较少，本研究显示其对41个阿尔茨海默病靶点有作用，在治疗阿尔茨海默病方面有潜力，后续可对其药理作用进一步研究。荷叶碱（nuciferine）、O-去甲基荷叶碱（O-nornuciferine）、亚美罂粟碱（armepavine）、北美鹅掌楸尼定碱（lirinidine）是从荷叶中提取的生物碱，是荷叶的主要活性成分[28]。既往研究发现，荷叶碱具有明显的抗炎活性[29]，荷叶碱衍生物具有较高的抗乙酰胆碱酯酶活性[30]，荷叶醇提取物对缺血脑组织具有抗自由基损伤的作用[31]，可能对阿尔茨海默病有一定的治疗作用。

在PPI网络中，APP是该网络的中心节点，度值最大，MAPK1、MAPK3也是度值较大的重要节点。对PPI的模块分别进行富集分析，评分最高的是模块3，涉及G蛋白偶联受体信号通路（与cAMP第二信使偶联）、神经活性配体-受体相互作用。在药物-关键成分-靶点-通路网络中，度、介度、紧密度较高的靶点有ESR2、ESR1、EGFR、DRD2、ACHE，这些靶点与关键成分及主要通路的联系较多且关联密切，提示上述靶点及其参与的通路可能是复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在机制。

APP即淀粉样β前体蛋白（amyloidbetaprecursorprotein），β淀粉样蛋白（Aβ）的积累和老年斑/神经炎性斑块的形成是阿尔茨海默病的显著特征，并广泛用于阿尔茨海默病的神经病理学诊断[32]。Aβ级联假说是关于阿尔茨海默病发病机制的重要假说之一，该假说认为，Aβ沉积驱动tau蛋白磷酸化、缠结形成、突触丢失、神经元死亡和认知损害[33]。正常情况下，β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶对APP的顺序切割产生Aβ肽链。生理条件下，Aβ保持稳定水平，是多种生理功能所必需的。在阿尔茨海默病中，由于APP和（或）早老素（PSEN1和PSEN2）基因的突变，Aβ的产生增加[32,34]。在PPI网络中，APP与BACE1、PSEN1、PSEN2相连，提示复方苁蓉益智胶囊可能通过影响Aβ的产生发挥抗阿尔茨海默病的作用。

MAPK1、MAPK3基因编码MAP激酶家族的成员。MAP激酶也称为细胞外信号调节激酶（ERK），参与多种细胞过程，是tau蛋白激酶的一种[16]。微管是维持细胞完整性的关键因素之一，tau蛋白在微管的稳定性中起着重要作用[35]。在阿尔茨海默病中，tau蛋白被过度磷酸化，形成神经纤维缠结，并失去了与脑细胞微管结合的韧性，破坏了神经元的可塑性并导致神经退行性变[36]。微管相关tau蛋白（MAPT）基因表达水平与阿尔茨海默病神经退行性严重程度有关，并且与已知的tau激酶（CDK5,MAPK1/ERK2）以及细胞内（Ras-ERK）激活途径有关[37]。推测复方苁蓉益智胶囊可能通过降低MAPK的表达减少tau蛋白的形成，进而减轻神经退行性变的程度。在对潜在靶点进行KEGG通路富集分析的20类主要通路中，MAPK1、MAPK3分别与8类通路有关，是涉及最多主要通路的潜在靶点，说明MAPK1、MAPK3是复方苁蓉益智胶囊发挥药效的重要靶点。

ESR2、ESR1基因分别编码雌激素受体β（ERβ）、雌激素受体α（ERα）。ESR1基因变异与女性患阿尔茨海默病的风险增加有关[38]，年龄相关的雌激素丢失是女性特有的阿尔茨海默病风险因素[39]。雌激素可增加脑血流量，充当抗炎药，增强神经元突触的活性，并对脑组织产生直接的神经保护作用和神经营养作用，女性雌激素替代疗法可能会降低阿尔茨海默病的风险[40]。复方苁蓉益智胶囊可能通过调节雌激素受体的表达及其下游效应产生疗效。

表皮生长因子受体（EGFR）是一种受体酪氨酸激酶，在细胞黏附、增殖、迁移和凋亡等过程中发挥重要作用[41]，具有神经保护作用，其下调可能与阿尔茨海默病有关[42]。EGFR的功能也受到早老素1(PSEN1）表达的影响[43]。推测复方苁蓉益智胶囊可能通过调节EGFR及其上下游途径发挥神经保护作用。

多巴胺受体D2(DRD2）是G蛋白偶联受体家族的成员，参与运动、奖励、强化、记忆与学习的调节[44]。海马D2受体在阿尔茨海默病的记忆和命名功能中发挥作用[45]，多巴胺能神经递质水平的降低与阿尔茨海默病的病理生理学有关[46]。一些研究表明，多巴胺在突触可塑性机制中起主要作用[47]，进行性突触紊乱、神经传递障碍和细胞丢失将进一步引起淀粉样蛋白、老年斑的细胞外沉积和细胞内的纤维缠结，从而诱发痴呆前症状，如活动减少，步态障碍和认知功能下降[48]。乙酰胆碱（ACh）在突触间隙与其受体结合，在外周和中枢神经系统中起重要作用。突触丢失是阿尔茨海默病进展的主要相关因素[49]。动物实验研究显示，复方苁蓉益智胶囊能增加血管性痴呆大鼠大脑皮层区多巴胺的含量，提高大鼠海马区Ach含量，而降低乙酰胆碱酯酶（AchE）含量，改善血管性痴呆大鼠海马神经元突触的超微结构[50]，从而改善其学习记忆功能。可见，复方苁蓉益智胶囊可能通过作用于多巴胺能系统及胆碱能系统改善阿尔茨海默病患者的认知功能。

本研究基于网络药理学方法对复方苁蓉益智胶囊活性成分进行靶点预测和通路分析，通过建立“关键成分-靶点-通路”网络图，探索复方苁蓉益智胶囊治疗阿尔茨海默病的潜在作用机制。研究结果表明肉苁蓉和荷叶在复方中占主要地位，复方苁蓉益智胶囊的同一化合物可作用于不同靶点，而同一靶点可调控不同的生物学过程及信号通路，具有多靶点、多通路联合作用的特点。这提示通过网络中的单个或多个重要靶点，可对整个网络进行调节，为临床运用复方苁蓉益智胶囊提供了科学依据，为后续进行药物临床疗效评价提供了可能的指标。

通过网络得到的重要活性成分主要是以荷叶碱为代表的生物碱，但对荷叶碱的药代动力学研究表明，其在体内的吸收相对较迅速，但吸收率较低，体内组织分布较为广泛，消除过程较迅速，生物利用度也较低[51]。这提示在筛选化合物时，需要对化合物的药代动力学及类药性进行更严格的规定。然而，中药成分的含量、浓度对药效有影响，筛选活性成分时可能剔除了复方中含量高但胃肠道吸收较差的药物。此外，中药发挥疗效不是单一化学成分作用的简单加和，可能是一个由多种化学成分构成的药效组分群[52]，所以从“关键成分-靶点-通路”网络中将每个化合物割裂开来分析是不够全面的。并且中药复方内多种化学成分可能会发生复杂的化学反应，产生新的衍生物或有效成分，网络药理学技术并未涉及这一部分。这些问题需要更先进的实验技术以及数据库、算法来不断完善，以对中药及复方的药效及作用机制进行更深入的研究。

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