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艾司洛尔对缺氧复氧诱导的心肌细胞通路及凋亡的影响

2021-03-04 411 上传者：管理员

摘要：目的探讨艾司洛尔对缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响，并初步研究其作用机制。方法体外培养大鼠心肌细胞（H9c2），并建立缺氧/复氧（I/R）损伤模型，随机分为对照组、H/R组和艾司洛尔低、中、高剂量（0.2、5.0、25.0μmol/L）组；噻唑蓝（MTT）法检测各组H9c2细胞存活率变化情况；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（AnnexinV-FITC/PI）法检测各组H9c2细胞凋亡情况；蛋白印迹分析法检测各组H9c2细胞Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱天冬氨酸酶-3(Caspase-3）、Bcl-2蛋白及腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化水平；实时荧光定量PCR(qRT-PCR）法检测各组H9c2细胞AMPK、GSK-3βmRNA表达情况。结果与对照组相比，H/R组H9c2细胞存活率、Bcl-2蛋白表达水平、AMPK、GSK-3β蛋白磷酸化水平显著降低（P<0.05），细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞存活率、Bcl-2蛋白表达水平、AMPK、GSK-3β蛋白磷酸化水平依次升高（P<0.05），细胞凋亡率、H9c2细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平依次降低（P<0.05），均呈剂量依赖性。结论艾司洛尔能够抑制I/R诱导下心肌细胞的凋亡，可能与激活AMPK/GSK-3β磷酸化水平相关。

关键词：
凋亡
心肌细胞
糖原合酶激酶3β
缺氧复氧
腺苷单磷酸激活的蛋白激酶
艾司洛尔
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心血管疾病是仅次于恶性肿瘤的第二大死亡诱因，与心肌细胞损伤和心脏功能障碍密切相关[1,2]。抗血小板和抗凝治疗、冠状动脉介入和血管形成治疗及时恢复冠状动脉血流灌注是治疗心血管疾病的最有效方法[3]。然而，心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤与预后不良相关，可能导致心肌细胞死亡，加重心肌损伤[4,5]。因此，寻找可以有效预防I/R损伤的治疗方法成为心肌保护研究领域的热点。艾司洛尔是一种高选择性的β1受体阻滞剂，输注艾司洛尔能够减少脂多糖诱导的小鼠心脏功能损害，并抑制心肌细胞凋亡[6]。腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）作为细胞的能量调节因子，其与糖原合酶激酶3β（glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β）信号通路的激活能够抑制大鼠心肌细胞凋亡[7]。但艾司洛尔对IR诱导心肌细胞损伤的影响及其与AMPK/GSK-3β信号通路的关联尚不清楚。本实验旨在探索艾司洛尔对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）诱导的心肌细胞凋亡的影响，并初步探索其作用机制，为艾司洛尔在I/R损伤的临床应用提供参考。

1、材料

1.1细胞、药品与试剂

大鼠心肌细胞H9c2(GNR5）购自中国科学院细胞库；盐酸艾司洛尔注射液（批号：1-19991059）购自齐鲁制药有限公司；DMEM高糖（11995）/无糖（90113）培养基、噻唑蓝（MTT）试剂（批号：M8180）、RIPA裂解液（批号：R0010）、胎牛血清（批号：11011-8611）、0.25%胰蛋白酶消化液（批号：T1350）、Trizol试剂盒（批号：15596-018）、ECL发光液（批号：PE0010）、逆转录试剂盒（批号：T2210-200T）购自北京Solarbio公司；AMPK、GSK-3β及GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体（批号：PA5-27094）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein,Bax）兔抗鼠多克隆抗体（批号：PA5-11378）、Caspase-3兔抗鼠重组单克隆抗体（批号：700182）、AMPK兔抗鼠重组单克隆抗体（批号：MA5-32122）、p-AMPK兔抗鼠重组单克隆抗体（批号：PA5-104982）、GAPDH兔抗鼠多克隆抗体（批号：PA1-16777）、山羊抗兔lgG(H+L）二级抗体（批号：A32731）购自美国ThermoFisherScientific公司；GSK-3β兔抗鼠单克隆抗体（批号：AG751）及p-GSK-3β兔抗鼠多克隆抗体（批号：AG763）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2主要仪器

BBD6220二氧化碳细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司，）；ELX-8081U酶标仪、GelDocTMXR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；ZS-AE7S流式细胞仪[中生（苏州）医疗科技有限公司]；2720型PCR仪（美国ABI公司）；MA100N倒置显微镜（日本Nikon）。

2、方法

2.1细胞培养

将10%胎牛血清和100mg/mL双抗添加至DMEM培养基，制成DMEM完全培养基。将购买的H9c2细胞复苏、解冻后，用DMEM完全培养基重悬，置于37℃、5%CO2环境下孵育，每2～3天更换一次新鲜培养基，将细胞传代或70%～80%融合后，胰酶消化收集，用于后续实验。

2.2H/R模型的建立[8]及实验分组

待“2.1”项H9c2细胞融合70%左右，更换培养液为无血清低糖DMEM培养基（模拟缺血），置于缺氧培养环境（37℃，5%CO2、95%N2）持续培养6h，模拟缺氧过程。随后更换培养液为高糖DMEM完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养6h，模拟复氧过程。收集上述H9c2细胞，随机分为H/R组及艾司洛尔低、中、高剂量组，分别用不同浓度的艾司洛尔（0.2、5.0、25.0μmol/L，该浓度是由前期预试验确定；在该浓度范围内，艾司洛尔对正常H9c2细胞无影响）处理各组细胞24h,H/R组不做药物处理，收集细胞用于后续实验。另取“2.1”项正常培养的H9c2细胞，设置为对照组。

2.3MTT实验

将H9c2细胞接种于96孔细胞板（4.5×104个/孔），每组6个复孔，按照“2.2”项步骤处理后，加入200μL/孔MTT溶液，孵育4h，每孔加入200μL二甲基亚砜溶解紫色晶体，利用酶标仪在490nm处记录各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。

2.4AnnexinV-FITC/PI实验

收集“2.2”项各组H9c2细胞，按照AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书，重悬细胞至密度为1.0×106个/mL。取100μL置于离心管，依次加入10μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻吹打混匀，避光保存15min，添加400μL结合缓冲液稀释后，1h内在流式细胞仪上检测各组细胞凋亡情况。

2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR）实验

参照Trizol试剂盒说明书，提取“2.2”项各组H9c2细胞总RNA，逆转录反应得cDNA。取1.0μLcDNA，上下引物各1μL，进行PCR扩增。PCR反应参数设置如下：95℃预变性3min,95℃变性15s,60℃退火45s,72℃延伸30s，进行40次循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算AMPK、GSK-3β表达情况。AMPK、GSK-3β及GAPDH引物序列见表1。

表1AMPK、GSK-3β和内参GAPDH引物序列

2.6蛋白免疫印迹分析实验

收集“2.2”项各组细胞，4℃下加入RIPA裂解液，裂解30min，离心收集上清液，采用BCA法检测蛋白质量浓度。分别取30μg蛋白质，10%SDS-PAFE凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2h,4℃下加入一抗AMPK、p-AMPK、GSK-3β、p-GSK-3β、Bax、Caspase-3、Bcl-2(1∶1000）及GAPDH(1∶5000），孵育过夜，洗涤、加入二抗（1∶5000），室温孵育2h，曝光显影，观察条带并记录，以GAPDH为内参，计算目标蛋白与内参GAPDH比值。

2.7统计学方法

以统计学软件SPSS22.0分析实验数据，计量资料以描述，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1艾司洛尔对H/R诱导的H9c2细胞活性影响

与对照组相比，H/R组H9c2细胞存活率显著降低（P<0.05）；与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞存活率依次升高（P<0.05），呈剂量依赖性。见表2。

表2艾司洛尔对H/R诱导的H9c2细胞存活率的影响

3.2艾司洛尔对H/R诱导的H9c2细胞凋亡的影响

与对照组相比，H/R组H9c2细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞凋亡率依次降低（P<0.05），呈剂量依赖性。见图1和表3。

3.3艾司洛尔对H/R诱导下H9c2细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3及Bcl-2表达的影响

与对照组相比，H/R组H9c2细胞Bax、Caspase-3蛋白水平显著升高（P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著降低（P<0.05）；与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平依次降低（P<0.05),Bcl-2蛋白水平显著升高（P<0.05），呈剂量依赖性。见图2和表4。

3.4艾司洛尔对H/R诱导下H9c2细胞AMPK、GSK-3β表达的影响

与对照组相比，H/R组H9c2细胞AMPK、GSK-3β蛋白磷酸化水平显著降低（P<0.05）；与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞AMPK、GSK-3β蛋白磷酸化水平依次升高（P<0.05），呈剂量依赖性。见图3和表5。

图1各组H9c2细胞凋亡变化情况

表3艾司洛尔对H9c2细胞凋亡率的影响

图2各组H9c2细胞Bax、Caspase-3及Bcl-2蛋白表达电泳图

表4艾司洛尔对H9c2细胞Bax、Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的影响

4、讨论

细胞凋亡级联反应、氧化应激和炎症等是I/R引起心肌组织受损的主要原因，但临床试验尚未发现用于减轻I/R损伤的有效药物[9]。因此开发预防I/R损伤的有效干预措施和策略具有重要临床意义。H/R诱导心肌细胞损伤模型已被广泛用于模拟体内心肌I/R损伤[10]，本研究结果显示，与对照组相比，H/R组H9c2细胞存活率显著降低，凋亡率显著升高，表明成功构建了H/R损伤模型。

心肌细胞凋亡与I/R损伤密切相关，可能导致心肌收缩功能障碍，加重心肌损伤[11]。Bcl-2和Bax蛋白是Bcl-2多基因家族的主要成员，主要通过调节线粒体的通透性发挥凋亡调控机制[12,13]。Caspase-3是调控细胞凋亡的关键因子之一，研究证实[14,15],Bcl-2家族能够激活Caspase-3信号传导，参与调节细胞凋亡反应。本研究发现，与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞存活率、Bcl-2蛋白显著升高，凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白显著降低，提示艾司洛尔能够促进H/R诱导下心肌细胞的增殖，并诱导凋亡。Quintana-Villamandos等[16]研究发现，艾司洛尔短期治疗能够发挥心脏保护作用。此外，低剂量的盐酸艾司洛尔可以降低心肌梗死患者的心肌损伤[17]。因此推测，艾司洛尔可能通过抑制I/R诱导的心肌细胞损伤及凋亡，减缓H/R诱导的心脏功能障碍。

图3各组H9c2细胞AMPK、GSK-3β蛋白表达电泳图

表5艾司洛尔对H9c2细胞AMPK、GSK-3βmRNA及蛋白磷酸化水平的影响

AMPK结构包含α亚基、β亚基和γ亚基，高度敏感于细胞内的能量变化[18]。李燕等[19]研究发现，激活AMPK蛋白表达，与抑制小鼠心肌组织凋亡相关。此外，激活AMPK信号通路能够限制I/R损伤大鼠的心肌梗死面积，发挥心脏保护作用[20]。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸酶，已被证实参与调节细胞凋亡[21]。本研究发现，与H/R组相比，艾司洛尔低、中、高剂量组H9c2细胞AMPK、GSK-3β蛋白磷酸化水平呈剂量依赖性升高，提示艾司洛尔可能通过激活AMPK/GSK-3β磷酸化水平，抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡。Li等[22]证实，GSK-3β通过激活AMPK蛋白表达，抑制内毒素脂多糖诱导的心肌细胞凋亡，与本研究结果一致，推测艾司洛尔可能是用于I/R损伤治疗的潜在有效药物。

综上所述，艾司洛尔能够促进H/R诱导下心肌细胞的增殖、并抑制其细胞凋亡，可能与激活AMPK/GSK-3β磷酸化水平相关，表明艾司洛尔在改善I/R损伤方向的潜在治疗价值，可能为预防心血管疾病I/R损伤并发症提供了理论参考。本实验将进一步联合小鼠模型和临床试验，针对艾司洛尔对I/R损伤造成的心脏功能障碍进行积极深入的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献：

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[18]赵汝舟,余志斌,张琳.缺氧预处理激活AMPK对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].解放军医学杂志,2019,44(2):36-42.

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基金:河南省中医药科学研究专项课题(2019ZY2139)