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清热化湿方治疗幽门螺杆菌胃炎的机制

2021-04-16 391 上传者：管理员

摘要：目的:基于临床实践和前期实验结果，运用网络药理学的方法探讨清热化湿方治疗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)胃炎的物质基础和分子生物学机制。方法:利用中药及疾病数据库获取清热化湿方干预Hp胃炎的靶点；借助Cytoscape软件和STRING平台构建“中药-成分-靶点”网络和蛋白质相互作用网络，进行可视化分析，筛选核心成分和关键靶点；利用DAVID数据库对靶点进行富集分析。结果:共得到清热化湿方活性成分80个，干预Hp胃炎的靶点93个；可视化分析筛选出6个核心成分和7个关键靶点；富集分析显示清热化湿法方主要参与抗病原体、调控炎症反应和癌症进程。结论:清热化湿方对Hp胃炎的作用机制体现了中药复方通过复杂成分和多个靶点、多条途径治疗的特点，为进一步的实验研究和新药开发提供证据。

关键词：
幽门螺杆菌胃炎
消化性溃疡
清热化湿方
网络药理学
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幽门螺杆菌(Helicobactorpylori,Hp)作为胃内最常见的致病微生物可引发胃黏膜炎性反应，大部分(70%～90%)慢性胃炎患者有Hp感染；Hp现症感染者几乎均存在慢性活动性胃炎[1]。同时，Hp是消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌的重要危险因素[2],Hp感染已然成为公共健康问题。《第5次全国幽门螺杆菌感染共识》指出，除非有制衡因素，否则Hp胃炎患者都应接受根除治疗[3]。目前西医的疗法主要包括抗生素根除、抑酸、调整胃肠运动，促进消化、保护胃黏膜等，但存在不良反应和抗生素耐药等问题。中西医整合治疗Hp相关疾病可缓解症状、减少不良反应及抗生素疗程，正在成为一种新的补充方法[4,5]。

清热化湿方是北京大学第一医院院内制剂，在经典名方三仁汤和半夏泻心汤的基础上化裁而成，有宣上、畅中、渗下之功。主要用于治疗胃肠道疾病属脾胃湿热证者，对Hp相关性胃炎和胃溃疡具有良好效果。本课题组既往研究发现清热化湿方在体外对Hp具有直接抑菌杀菌作用，且可以保护Hp感染小鼠胃黏膜，有效降低Hp定植密度，减轻胃黏膜炎症，但相关的物质基础及分子生物学机制不明[6,7]。网络药理学是复方研究的新模式，其系统性的研究特点与中医的整体观和多效性相符。本研究运用网络药理学的方法对清热化湿方治疗Hp胃炎的机制进行探讨，为进一步的实验研究和新药开发提供参考依据。

1、资料与方法

1.1活性成分的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索清热化湿方中各药物的活性成分。根据药物代谢动力学，口服生物利用度(oralbioavailability,OB)、类药性(drug-likeness,DL)及药物半衰期(drughalf-life,HL)均是筛选活性成分的重要参数，因此以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4为标准进行筛选。由于无法在TCMSP数据库检索到“蒲公英”,我们通过中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)和文献检索补充。

1.2靶点的预测

通过TCMSP数据库获取清热化湿方中活性成分的靶蛋白，然后将靶蛋白的信息导入UniProt数据库，物种选择“HomoSapiens”或“Helicobacterpylori”,从而得到对应的规范化的靶基因名称。通过SwissTargetPrediction数据库对活性成分进行靶点预测，作为补充。通过GeneCards、OMIM及Drugbank数据库检索关键词“Helicobacterpylorigastritis”,查询Hp胃炎相关靶点，合并后删除重复项。制作韦恩图，活性成分相关靶点与Hp胃炎相关靶点的交集(重合靶点)即为清热化湿方活性成分作用于Hp胃炎的靶点。

1.3“中药-成分-靶点”网络的构建及关键活性成分的筛选

根据以上结果，使用Cytoscape软件(Version3.7.2)构建“中药-成分-靶点”网络模型，并利用Networkanalyzer功能进行分析，以节点的度值为主要标准寻找在网络中发挥核心作用的活性成分。

1.4蛋白质相互作用关系网络的构建及关键靶点的筛选

将共同靶点上传到STRING平台，设置连接评分最小值为0.9,构建蛋白质相互作用关系(protein-proteininteraction,PPI)。利用Cytoscape软件可视化，以度值为标准并结合MCODE算法和cytohubba算法，筛选关键靶点(hub蛋白)。

1.5基因富集分析

将靶点信息导入DAVID数据库，对清热化湿方活性成分作用于Hp胃炎的靶点进行基因本体(GeneOntology,GO)富集分析以及京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)富集分析。以P<0.05为筛选标准，得到这些靶点显著富集的GO和KEGG条目。使用R语言(Version3.6.2)ggplot2包对结果进行可视化处理。

2、结果

2.1活性成分筛选结果

共得到98个活性成分，其中半夏11个，苍术7个，车前草10个，豆蔻10个，茯苓14个，厚朴1个，黄连10个，苦杏仁12个，薏苡仁7个，栀子11个，蒲公英5个，除去18个重复成分，最终得到80个活性成分，见表1。

表1清热化湿方的活性成分

2.2清热化湿方治疗Hp胃炎潜在靶点

共得到所有药物活性成分的预测靶点1572个，除去重复靶点，共得到靶点535个。得到Hp胃炎相关靶点301个。将二者映射，相交部分即共同靶点共93个。

2.3“中药-成分-靶点”网络构建及关键活性成分分析

将上述的11种单味药材、80个活性成分和93个潜在靶点导入Cytoscape软件，得到“中药-成分-靶点”网络模型，网络共包括184个节点(其中20个活性成分没有与潜在靶点直接相连)和731条边，如图1所示。每个节点的度值越大，表示该节点与其他节点的相互作用越广泛，在网络中起到枢纽作用。度值排名前6(Degree≥15)的活性成分分别是槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、黄芩素(baicalein)以及掌叶大黄二蒽酮A(PalmidinA),其基本信息见表2。

2.4PPI网络的构建及关键靶点分析

PPI网络图如图2所示，共涉及87个节点(隐藏了6个游离节点)、397条边。节点的色彩越明亮、直径越大代表度值越大。度值≥20的靶蛋白有10个，从大到小分别为TP53、JUN、AKT1、TNF、MAPK1、MAPK3、IL6、VEGFA、PIK3CA、CTNNB1,表明这些蛋白质在整个网络中占据重要的地位，其基本信息见表3。MCODE算法显示这10个蛋白均在得分最高的模块1,cytohubba算法显示前7个为hub蛋白。

2.5基因富集分析

2.5.1GO功能富集分析

共得到GO条目525个，其中生物过程(biologicalprocess,BP)条目422个、细胞组成(cellularcomponent,CC)条目36个、分子功能(molecularfunction,MF)条目67个。根据“-lgP”值排序，各模块排序前10的条目见图3。BP条目主要包括凋亡过程负调控、缺乏配体时外源性凋亡信号通路、衰老、对药物的反应、对有毒物质的反应、对抗生素的反应等；CC条目主要包括细胞外间隙、胞质、蛋白复合物、线粒体、细胞外外来体等；MF条目主要包括蛋白结合、酶结合、转录因子结合、细胞因子活性、生长因子活性等。

2.5.2KEGG通路富集分析

共得到KEGG条目113条，根据“-lgP”值排序，排序前20位的通路如图4所示。结果显示，清热化湿方治疗Hp胃炎主要参与TNF信号通路、T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、乙型肝炎、癌症、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型感染、弓形虫病、利什曼原虫病等信号通路。

图1“中药-成分-靶点”网络

表2关键活性成分

图2清热化湿方PPI网络

表3关键靶点

3、讨论

根据临床症状，Hp胃炎可归属于中医“胃痛”“痞满”等范畴。Hp作为外源性致病微生物，属中医“外邪”范畴。Hp经口侵袭脾胃，脾胃虚弱则运化失司，水湿内生，内外合邪，则成湿热内蕴证候。前期通过证候要素横断面研究及Hp感染者舌象横断面研究，发现Hp现症感染多具有湿、热的特点[8,9]。研究显示，具有清热、化湿类作用的方药治疗Hp胃炎取得较好疗效[10,11]。因此清热化湿方治疗Hp胃炎符合中医的“理-法-方-药”,并且临床实践和前期实验结果证实了此方的疗效，但相关的物质基础和分子生物学机制尚不清楚。

通过网络药理学分析，共筛选出清热化湿方活性成分80个，“中药-成分-靶点”网络模型显示核心成分主要有槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、黄芩素和掌叶大黄二蒽酮A。已有研究表明槲皮素能降低Hp感染小鼠中炎症因子的水平，调节胃细胞增殖/凋亡平衡[12]。木犀草素是一种常见于药用植物的类黄酮，在体内和体外均具有很强的抗炎活性[13]。山奈酚可在体外抑制CagA和VacA蛋白的易位并导致促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-8)下调[14]。黄芩素能在体外抑制Hp的活性和VacA的表达，干扰Hp的黏附和侵袭能力，降低IL-8的表达；在小鼠体内抑制Hp的生长，降低IL-1β的水平[15]。汉黄芩素和掌叶大黄二蒽酮A尚未发现相关报道。

图3GO富集分析

图4KEGG通路富集分析

通过靶点映射找到清热化湿方治疗Hp胃炎的93个作用靶点，PPI网络揭示了核心靶点(hub蛋白)主要有TP53、JUN、AKT1、TNF、MAPK1、MAPK3和IL6,核心靶点均与Hp致病密切相关。转录因子AP-1(JUN对应蛋白)是免疫应答的重要调节蛋白，研究显示Hp可通过AP-1刺激巨噬细胞产生促炎递质[16]。TNF是机体炎症的重要调节因子，Hp感染后可通过多种组分直接刺激胃黏膜上皮细胞并招募免疫细胞，上调促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等[17]。TP53是重要的抑癌基因，Hp可通过注射CagA以及降解p53蛋白，促进肿瘤进程[18]。Hp的毒力因子CagA可以激活PI3K/AKT1信号通路并诱导AKT1磷酸化，参与胃癌进程[19]。Hp的脂多糖可以与胃黏膜Toll受体4结合，通过激活ERK1/2(MAPK3/MAPK1对应蛋白),促进胃黏膜上皮细胞的增殖[20]。MaastrichtV共识指出，根除Hp可降低胃癌发展风险[21]。我国胃癌新发病例及死亡率均居全球第2位，因此积极防治Hp胃炎，调控癌症进程具有重要意义。

GO富集分析表明清热化湿方的作用靶点分布在多种细胞组分中，通过多种结合方式参与多种生物进程。KEGG富集分析显示清热化湿方主要参与TNF信号通路、T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、乙型肝炎、癌症、结直肠癌、弓形虫病等多条通路，主要与抗病原体、调节免疫和炎症以及调控癌症进程相关。研究表明，中草药对Hp的作用，突出显示为其抗炎和抗癌的细胞通路，因此分析结果有较高可信度[22]。TNF与受体结合后，可以激活下游NF-κB及MAPK信号通路，二者已被证实在Hp感染相关疾病中发挥重要作用[23]。因此将TNF信号通路作为进一步研究的方向。

复方中大部分活性成分都存在多个靶点，同一个靶点也可对应多个活性成分，富集在不同通路。此次分析体现了中药复方通过复杂成分和多个靶点、多条途径治疗的特点，为进一步实验研究和新药研发提供了理论依据和方向，如TNF信号通路及富集在此通路上的核心蛋白TNF、IL-6、JUN、AKT1等。但是通过网络药理学方法预测作用机制存在一定不足，如所筛选的活性成分可能与Hp胃炎患者实际吸收的成分不一致、无法区分活性成分对靶点的作用是激活还是抑制、预测结果可能会受到对“明星分子”“热点途径”的偏倚影响等。因此，预测结果需要进一步的实验验证。

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