心脏毒性是蒽环类化疗药物最常见的副作用之一，与累积剂量相关的扩张型心肌病、充血性心力衰竭等严重心血管并发症限制了此类药物的应用。既往文献[1]报道，蒽环类代表药物多柔比星致左心室功能障碍的发生率最高达48%。因此，预防或减轻蒽环类药物引起的心脏毒性是肿瘤心脏病学研究的热点之一。中医药在防治蒽环类药物心脏毒性方面具有一定作用[2]。中医学认为，化疗药物属于“热毒之邪”,其性燥热，蕴于体内煎灼津液，耗气伤阴，进而导致气阴两虚[3],故气阴两虚为蒽环类药物心脏毒性的主要病机，临床上常以益气养阴立法遣方[4]。黄芪甘、微温，补中益气，《本草备要》言其“炙用补中，益元气，温三焦”;太子参甘、微苦、平，补脾益气，生津养阴，《本草再新》曰其“治气虚肺燥，补脾土，消水肿，化痰，止渴”,二药相合，共奏益气养阴之功。以黄芪-太子参药对为基础组方的临床研究显示，其可降低蒽环类药物所致的心电图异常发生率，改善左心室射血分数和短轴缩短率[5],提高血清一氧化氮、超氧化物歧化酶(SOD)水平[6],降低血清肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、B型脑钠肽水平[7],具有预防和减轻蒽环类药物心脏毒性的作用。基础研究亦表明，以黄芪-太子参药对为基础的方药可降低心肌细胞中半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表达，增加B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白的表达，降低Bcl-2相关的X蛋白(Bax)蛋白的表达，从而抑制蒽环类药物导致的心肌细胞凋亡[8];同时还可降低血清丙二醛、乳酸脱氢酶含量，提高还原型谷胱甘肽、SOD活性，通过清除氧自由基而发挥抗氧化作用，有效防治蒽环类药物对心肌的毒性损伤[9]。本研究基于网络药理学方法对黄芪-太子参减轻蒽环类药物心脏毒性的主要活性成分、作用靶点、作用通路等方面进行探讨，旨在为其临床应用提供依据。

1、方法

1.1药物主要活性成分及作用靶点筛选

基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)和化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp),检索黄芪和太子参两味中药的所有活性成分。根据药物成分的药代动力学参数，以口服吸收利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为参数[10],筛选主要活性成分。将筛选获取的主要活性成分在TCMSP数据库和PharMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中检索其对应的作用靶点，运用UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)将靶点蛋白名称统一转换为基因名称，构建黄芪-太子参药对主要活性成分靶点库。

1.2蒽环类药物心脏毒性相关靶点收集

以anthracycline-inducedcardiotoxicity,doxorubicin-inducedcardiotoxicity,adriamycin-inducedcardiotoxicity,epirubicin-inducedcardiotoxicity为检索词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)检索相关靶点，整理后构建蒽环类药物心脏毒性相关靶点数据库。

1.3药物靶点与疾病靶点韦恩分析

利用Venny2.1在线分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/Index.html),将黄芪-太子参药对主要活性成分靶点库与蒽环类药物心脏毒性相关靶点数据库进行分析，得到交集基因，筛选黄芪-太子参药对治疗蒽环类药物心脏毒性的作用靶点。

1.4蛋白质-蛋白质相互作用关系网络(PPI)构建与分析

将韦恩分析得到的药物靶点与疾病靶点的共同靶点输入STRING(https://string-db.org/)数据平台，构建共同靶点PPI图，“organism”设置为“Homosapiens”,“minimumrequiredinteractionscore”设置为“highconfidence(0.7)”。将所得数据以“string_interaction.tsv”文件格式导入Cytospace3.7.1软件，利用cytoHubba插件和CentiScaPe插件进行拓扑分析，以点度中心度、接近中心度、中介中心度作为参数[11],筛选核心靶点。

1.5共同靶点的GO功能分析和KEGG通路富集分析

通过GO数据库和KEGG数据库，应用R语言软件对韦恩分析获得的共同靶点进行GO生物过程、分子功能、细胞组分富集分析和KEGG通路富集分析，所应用R包下载通过R(https://www.r-project.org/)和Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)获取。应用Cytospace3.7.1软件构建药物-成分-靶点-通路网络，以分析黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性的作用机制。

2、结果

2.1黄芪-太子参药对主要活性成分及作用靶点筛选结果

共筛选得到黄芪20个活性成分，太子参8个活性成分。去掉重复成分和未检索到作用靶点的活性成分，共计筛选出21个主要活性成分。利用TCMSP数据库和PharMapper数据库筛选靶点，检索到黄芪219个靶点，太子参95个靶点，去除重复靶点，剩余205个靶点。

2.2疾病靶点预测结果

共检索到蒽环类药物心脏毒性相关靶点165个，其中GeneCards数据库153个、OMIM数据库12个。

2.3药物靶点与疾病靶点韦恩分析结果

将205个药物靶点与165个疾病靶点输入Venny2.1软件绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点39个，度值≥20的靶点详见表1,这些靶点可视为黄芪-太子参药对治疗蒽环类药物心脏毒性的潜在靶点。

2.4药物活性成分-共同靶点网络关系图

将黄芪-太子参药对主要活性成分与药物疾病共同靶点输入Cytoscape3.7.1软件，建立一个各个节点联系密切的网络关系图，见图1。网络中共有56个节点和115条边，17个药物活性成分与39个共同靶点相对应，网络中的度指与该节点相关联边的条数，度值越高表明与该活性成分关联的靶点越多。在此网络中，药物活性成分的平均度值是6.76,度值排名前5位的分别是槲皮素(MOL000098,度值=32)、木犀草素(MOL000006,度值=17)、山柰酚(MOL000422,度值=12)、金合欢素(MOL001689,度值=7)、β谷固醇(MOL000358,度值=7),提示这些化合物是黄芪-太子参药对治疗蒽环类药物心脏毒性的关键活性成分。

表1黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性的药物疾病共同靶点

图1黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性药物活性成分-共同靶点网络图

2.5靶点蛋白相互作用网络分析

将上述筛选得到的39个药物疾病共同靶点导入到STRING数据库中，得到PPI网络，利用Cytoscape3.7.1软件中cytoHubba插件进一步分析PPI网络，结果见图2。图2网络中共包含39个节点，与402条边相交互，点度中心度、接近中心度、中介中心度的中位数分别为22、0.018519、9.87753。以点度中心度>22、接近中心度>0.018519、中介中心度>9.87753作为参数筛选核心靶点，AKT1、MAPK1、MAPK8、CASP3等靶点被视为黄芪-太子参药对治疗蒽环类药物心脏毒性的关键靶点。

图2黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性药物疾病共同靶点的PPI网络图

2.6GO功能分析与KEGG通路富集分析结果

将39个药物疾病共同靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO分析结果显示，生物过程主要富集在对氧化应激反应、对活性氧的反应、对金属离子反应、凋亡信号通路的调控等。分子功能集中于磷酸酶结合、抗氧化活性、蛋白磷酸酶结合等。细胞组分中涉及膜筏、膜微结构域、膜区域等，详见表2,提示黄芪-太子参药对可通过抗氧化应激、抗凋亡、调节金属离子代谢等机制减轻蒽环类化疗药物的心脏毒性。KEGG分析结果显示，共富集到115条信号通路，图3示，根据每条通路的P值从小至大进行排序，与蒽环类药物心脏毒性相关的通路为PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路和凋亡信号通路等。

2.7药物-成分-靶点-通路网络构建

将黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性相关作用靶点和KEGG通路信息导入Cytoscape3.7.1软件中，构建药物-成分-靶点-通路网络。图4示，同一成分对应多个作用靶点，多个成分对应同一靶点，每条通路与多个靶点相关联，体现了黄芪-太子参药对多成分、多靶点减轻蒽环类药物心脏毒性的作用特点。

图3黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性药物疾病共同靶点KEGG通路富集结果

表2黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性药物疾病共同靶点GO分析结果

3、讨论

以多柔比星为代表的蒽环类化疗药物具有良好的抗肿瘤效果，但由于其心脏毒性等严重副作用限制了该类药物的临床应用。蒽环类药物导致心脏毒性的确切机制尚存争议，目前的研究[12]表明其分子机制涉及氧化应激、细胞凋亡、细胞自噬、与拓扑异构酶2相关的脱氧核糖核酸(DNA)损伤等多个方面。本研究结果显示，黄芪-太子参药对主要活性成分通过AKT1、MAPK1、MAPK8、CASP3等药物疾病共同靶点起作用。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，AKT1是在心肌组织中高表达的1个亚型，对心肌细胞的生长、生存、凋亡和新陈代谢具有重要影响，AKT下调与蒽环类药物心脏毒性相关[13]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是一组丝/苏氨酸蛋白激酶，能够感受细胞外刺激并引发广泛的细胞内应答。活化的MAPK磷酸化多种靶蛋白，调控增殖、分化、凋亡、氧化应激、炎症等多种细胞活动[14]。蒽环类药物多柔比星可激活MAPK信号通路，促进凋亡蛋白的磷酸化，诱导氧化应激，导致心肌损伤[15]。Caspase-3属半胱氨酸蛋白酶家族，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。蒽环类药物通过上调Bax等促凋亡蛋白，促进细胞色素C从线粒体中释放，最终激活效应蛋白Caspase-3,导致心肌细胞凋亡[16]。

图4黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性药物-成分-靶点-通路网络图

GO功能分析显示，生物过程主要富集在氧化应激、对活性氧的反应、凋亡信号通路调节、对金属离子的反应等。蒽环类药物与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和细胞色素P450还原酶相作用，导致线粒体功能障碍，细胞内活性氧簇(ROS)生成增加，造成心肌细胞脂质过氧化物和DNA损伤[17]。药理学研究[18]显示，黄芪中的槲皮素通过上调14-3-3γ的表达，提高心肌细胞内源性抗氧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低丙二醛(MDA)和ROS水平，抑制氧化应激。山柰酚与Bax促凋亡基因的启动子区结合，抑制多柔比星激活的P53信号通路和细胞外调节蛋白激酶(ERK)依赖的MAPK通路，减轻多柔比星导致的氧化应激、凋亡损伤和线粒体功能障碍[19]。异鼠李素可抑制p-ERK1/2、p-JNK、p-p38的表达，通过MAPK信号通路，减轻多柔比星导致的氧化应激[20]。

细胞凋亡是蒽环类药物造成心脏毒性的另一机制。Bcl-2家族的表达和调控是细胞凋亡的关键因素之一，其中Bcl-2为凋亡抑制蛋白，Bax为促凋亡蛋白。PI3K/AKT、P53等通路通过上述蛋白调控细胞凋亡[17]。有研究结果显示，槲皮素通过上调Bmi-1表达，降低多柔比星诱导的P53表达，维持Bcl-2表达，抑制Bid表达，减轻因多柔比星诱导的线粒体去极化而导致的心肌细胞凋亡[21]。木犀草素可通过PTEN/Akt和ERK通路减轻多柔比星诱导的H9C2细胞的凋亡[22]。山柰酚通过P53介导、线粒体依赖的内在凋亡信号通路，抑制细胞色素C活性，降低Caspase表达，降低Bax/Bcl-2的比值，从而对抗蒽环类药物导致的心脏毒性。金合欢素则通过沉默信息调节因子1-腺苷酸活化蛋白激酶-Nrf2通路，减轻ROS生成和细胞凋亡[23]。以上体现了中药多成分、多靶点、多通路、综合调控的整体药效效应。

蒽环类药物还通过Fenton和Haber-Weiss反应或与铁形成复合物两条途径，增加心肌细胞内Fe2+含量，致羟自由基生成增多，进而导致脂质过氧化、核酸突变和蛋白质损伤[24]。研究[25]显示，抑制低氧诱导因子(HIF)活性，可减弱铁螯合剂的心脏保护作用，过表达HIF可减轻蒽环类药物导致心肌细胞死亡和凋亡。槲皮素通过激活低氧诱导因子1α(HIF-1α)通路，增加胃癌细胞内HIF-1α表达，诱导保护性自噬而发挥抗肿瘤作用[26]。木樨草素和金合欢素均可通过干预HIF-1α通路，降低血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9的表达，抑制肿瘤血管生成[27]。黄芪-太子参药对中多种主要活性成分均对HIF-1α通路存在影响，提示其可通过调控HIF-1α通路调节铁代谢而减轻蒽环类药物的心脏毒性。

本研究通过网络药理学方法筛选出黄芪-太子参药对21个主要活性成分和39个药物疾病共同靶点，137个生物过程、39个分子功能、36个细胞组分和115条信号通路，反映了黄芪-太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性方面的可能作用机制，为进一步验证其药理作用提供了研究思路。

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文章来源：王峰,王立新,刘芳茹,孟立,赵娜,翟兴荣,刘洪贵.基于网络药理学探讨黄芪太子参药对减轻蒽环类药物心脏毒性的作用机制[J].中医杂志,2021,62(11):994-1000.

基金：河北省中医药管理局中医药类科研计划项目(2020502)