老年性聋（age-related hearing loss,ARHL）是随着衰老而发生的进行性听力损失。在发达国家，约有1/3的65岁老年人存在不同程度的听力下降，这不仅影响他们的生活质量，还会导致认知障碍[1]。目前认为[2]，老年性聋是一种由噪音暴露、遗传等多因素共同作用而导致的疾病，其分子机制主要涉及氧化应激、凋亡、自噬等，病理改变包括毛细胞丢失、血管纹萎缩、螺旋神经节及听觉中枢的退行性变，而由听觉中枢退行性变导致的听力下降称为中枢性老年性聋。尽管抗氧化剂在延缓耳蜗毛细胞丢失方面取得了一定的进展，但多数抗氧化剂仅针对单一靶点发挥作用，其临床疗效有待确认，并且有关中枢性老年性聋治疗药物的研究较少。由于老年性聋的发病机制非常复杂，单一针对耳蜗的靶向治疗难以在其治疗中取得较好的疗效，因此需要寻找包括且不限于针对听皮层的综合治疗方案。

中医认为，耳与脑相通，肾精通过脑髓来滋养耳[3]。《医林改错》中对耳聋的描述，气血瘀滞阻塞耳与脑连接的通道是导致耳聋的原因。这些理论将肾-脑-耳-气血联系在一起，也成为补肾活血法治疗老年性聋的理论基础。补肾活血汤（Bushen Huoxue Decoction,BSHXD）由当归、独活、红花、熟地黄、酒萸肉、醋没药、盐菟丝子、杜仲、酒苁蓉、枸杞子、盐补骨脂等11种中药组成，在临床上治疗老年性聋具有较好的疗效，我们推测补肾活血汤能够通过延缓听皮层的衰老来治疗老年性聋，但该机制推论尚缺乏现代科学依据。

网络药理学是使用生物信息数据库，整合疾病相关基因、预测药物治疗疾病潜在靶点及通路，从而认识药物作用机制的一种新型药物研发模式，现已成为阐释中药复方科学依据的有效途径，运用网络药理学可最大限度地发挥中医药多化合物、多靶点、多途径特点的优势[4]。在本研究中，我们使用网络药理学方法筛选补肾活血汤与中枢性老年性聋的共同靶点，利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和基因本质论（Gene Ontology,GO）分析这些分子的生物过程和信号通路，通过蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）分析筛选出核心靶点，并选取自然衰老的C57BL/6J小鼠进行实验验证。本研究旨在将网络药理学与实验研究相结合，系统探讨补肾活血汤治疗中枢性老年性聋的潜在分子机制，为老年性聋的防治提供新的策略。

1、材料和方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 补肾活血汤与老年性聋共同靶点获取

使用TCMSP数据库、ETCM数据库、BATMAN-TCM数据库检索并筛选补肾活血汤活性成分和作用靶点。活性成分满足口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18和血脑屏障≥-0.3条件。使用UniProt数据库对靶点名称规范化。3个数据库检索结果合并且去除重复值。在Genecards数据库、DisGeNET数据库输入关键词“age related hearing loss”“presbycusis”，检索老年性聋病理机制靶点，结果合并且去除重复值。使用在线工具Venny 2.1获得补肾活血汤与老年性聋共同靶点，并保存韦恩图。通过Cytoscape3.9.0软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。

1.1.2 GO功能与KEGG通路富集分析

将补肾活血汤与老年性聋共同靶点导入DAVID数据库进行GO功能与KEGG通路富集分析。使用微生信在线工具绘制GO条形图与KEGG气泡图。

1.1.3 PPI分析与核心基因的筛选

将补肾活血汤与老年性聋共同靶点导入在线数据库STRING进行PPI分析，并将结果输入Cytoscape 3.9.0软件进行聚类分析。我们选取degree（度值）前十位的基因作为核心靶点进一步分析，并使用Cytoscape 3.9.0软件绘制核心靶点相互作用网络。

1.2 实验验证

1.2.1 动物

雄性C57BL/6J小鼠，30周龄28只、8周龄7只，SPF级，体质量（30±2)g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物质量合格证号：2022114782，于河南中医药大学SPF动物实验中心饲养。动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0027，饲养环境：恒温（24±2）℃，湿度55%～68%,12 h明暗循环，充足的食物和水。本实验已通过河南中医药大学伦理委员会审批，动物实验伦理编号为：DWLL202106202。

1.2.2 药物及试剂

补肾活血汤配方颗粒由熟地黄18 g、菟丝子18 g、补骨脂18 g、独活6 g、当归6 g、杜仲6 g、肉苁蓉6 g、枸杞子6 g、山萸肉6 g、没药6 g、红花3 g组成，均购自四川新绿色药业科技发展有限公司。PI3K抑制剂LY294002，批号：HY-10108，美国MCE公司；Bax（批号：GTX32465）、Caspase-3（批号：GTX110543），美国Genetex公司；PI3K（批号：17366）、AKT（批号：9272）、mTOR（批号：2983）、p-PI3K（批号：4257）、p-AKT（批号：4060）、p-mTOR（批号：5536），美国Cell Signaling Technology公司；内参抗体GAPDH，批号：GB12002，中国Servicebio公司；Alexa Flour488，批号：111-545-003，美国Jackson公司；一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，批号：KGA7062，中国凯基生物公司；总蛋白提取试剂盒（批号：BC3710-100T）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020），中国Solarbio公司。

1.2.3 主要仪器

MF52-M荧光生物显微镜，广州明美光电技术公司；JY-BMB石蜡包埋机，湖北锦源医疗科技有限公司；DYY-6D电泳仪、DYCZ-24DH电泳槽、WD9413C凝胶成像分析仪，北京六一公司。

1.2.4动物模型复制、分组及给药方法

所有小鼠适应性饲养1周后开展后续实验。本实验选择了自然衰老的30周龄C57BL/6J小鼠28只作为中枢性老年性聋小鼠模型，用听性脑干测试检验模型。C57BL/6J小鼠因其自身的基因缺陷在不加以特殊干预情况下即表现出加速衰老表型，是老龄化研究的常用动物模型，在4月龄时即表现出明显的听力损失，并随年龄增长进一步加重[5]。将小鼠随机分为模型组、补肾活血汤组、LY294002(LY）组、补肾活血汤+LY组，每组7只。根据人与小鼠体表面积折算等效剂量，补肾活血汤组以12.87 g·kg-1灌胃给药[6],LY组以1.5 g·kg-1PI3K抑制剂LY294002腹腔注射给药，补肾活血汤+LY组予以等量补肾活血汤灌胃和LY294002腹腔注射，模型组灌胃及腹腔注射等量生理盐水，每日1次，持续12周。对照组选用7只8周龄青年小鼠。

1.2.5标本采集与病理学检测

小鼠深度麻醉后，颈椎脱臼法处死，迅速取出脑组织置于4%多聚甲醛中，4℃下固定过夜。石蜡包埋并连续切片。将石蜡切片常规烤片，二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇水合，苏木素染色5 min，盐酸酒精分化，氨水碱化促蓝，伊红复染5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察，根据海马形态与位置定位听皮层区域并拍摄。

1.2.6 转移酶介导的dUTP切口末端标记（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）染色

听皮层石蜡切片常规烤片、脱蜡和水合，柠檬酸钠缓冲液抗原修复。TdT酶反应液室温避光孵育60 min。StreptavidinTRITC工作室温避光孵育30 min,DAPI(1∶1 000）染细胞核，室温避光反应10 min，封片，荧光生物显微镜拍摄，以ImageJ 1.53a软件进行计数与分析。

1.2.7 免疫荧光染色检测Caspase-3蛋白表达

听皮层石蜡切片烤片、脱蜡和水合，柠檬酸钠抗原修复。1%山羊血清封闭液室温封闭30 min。一抗Caspase-3(1∶800)4℃孵育过夜。二抗Alexa Flour 488 Donkey anti-Rabbit(1∶500）避光孵育2 h,DAPI(1∶1 000）染细胞核，室温避光反应10 min，封片，荧光生物显微镜拍摄，以ImageJ 1.53a进行量化与分析。

1.2.8 免疫印迹（Western Blot,WB）法测定Bax、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、GAPDH蛋白水平

参照图谱[7]快速分离听皮层组织，听皮层组织称质量，冰上切碎、裂解并匀浆，离心收集上清液。检测蛋白质浓度，加入上样缓冲液，以100℃、5 min变性。制胶，上样（40μg蛋白质/孔），电泳，转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗Bax(1∶1 500）、Caspase-3(1∶5 000);PI3K(1∶1 500）、AKT(1∶1 500）、mTOR(1∶1 500）、p-PI3K(1∶1 500）、p-AKT(1∶1 500）、p-mTOR(1∶1 500）、GAPDH(1∶1 000)4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗兔IgG室温孵育60 h，显影。使用ImageJ 1.53a进行量化与分析。实验设计流程见图1。

1.2.9 统计学处理方法

采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8.0统计软件，计量资料结果以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 补肾活血汤与老年性聋共同靶点及网络构建

通过TCMSP、ETCM和BATMAN-TCM数据库检索并筛选获得满足条件的补肾活血汤活性成分219种，所有成分作用靶点去除重复项后共有1 583个。通过Genecards和DisGeNET数据库总共获得了8 968个老年性聋相关靶点。将药物的作用靶点与老年性聋相关靶点输入在线工具Venny 2.1总共获得了1 118个补肾活血汤-老年性聋共同靶点，见图2。将这些结果导入Cytoscape构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络，见图3。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析

通过GO功能标注分析，共得到2 599个GO功能，包括1 947个生化过程（BP),398个分子功能（MF）以及254个细胞组分（CC），见图4。在BP中前10位包括：RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、信号转导、基因表达的正向调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负向调控、转录的正向调控、DNA模板化、凋亡过程的负向调控、细胞增殖的正向调控、药物反应、化学突触传递、细胞增殖的负向调控。KEGG分析显示这些靶基因涉及205条信号通路，其中最重要的10条通路是代谢通路、癌症通路、神经活性配体受体相互作用通路、神经退行性变-多种疾病通路、钙信号通路、cAMP信号通路、阿尔茨海默病、癌症蛋白多糖、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路，见图5

2.3 PPI网络构建与核心靶点筛选

在String数据库中，进一步分析了1 118个共同靶点的相互作用，并绘制PPI网络图，见图6。degree值排前10位的基因分别是SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、JUN、HSP90AA1、HDAC1。再进一步分析这些核心靶点之间的相互作用关系，见图7；分析这些核心靶点与KEGG富集分析结果的关系，见图8。

2.4 听皮层HE染色

见图9。对照组听皮层神经元染色均匀，形态饱满，排列整齐致密，细胞核呈类圆形，细胞膜、核膜清楚。模型组海马区神经元染色不均匀，排列杂乱、分布疏松，可见神经元坏死，细胞核固缩，细胞膜，核膜不清晰，层次散乱。与模型组比，补肾活血汤组神经元排列较整齐，神经元病理表现较模型组有明显改善。LY组与补肾活血汤+LY组神经元病理表现与补肾活血汤组近似。

2.5 听皮层细胞Caspase-3的免疫荧光检测

见图10。在听皮层中Caspase-3主要在神经元细胞质内表达。模型组小鼠听皮层Caspase-3(P<0.001）表达明显上调；相比于模型组，补肾活血汤组、LY组、补肾活血汤+LY组Caspase-3表达明显下调（P<0.001）；相对于补肾活血汤组和LY组，补肾活血汤+LY组的Caspase-3表达进一步下调（P<0.05,P<0.01）。

2.6 听皮层细胞TUNEL染色

见图11。模型组小鼠听皮层细胞凋亡阳性细胞明显增多（P<0.001）；而相比于模型组，补肾活血汤组、LY组与补肾活血汤组+LY组凋亡阳性细胞明显降低（P<0.001）；相对于补肾活血汤组和LY组，补肾活血汤+LY组的凋亡阳性细胞数进一步降低（P<0.05）。

2.7 WB检测听皮层PI3K/AKT/mTOR信号通路与细胞凋亡相关蛋白表达

见图12。模型组小鼠听皮层Bax、Caspase-3表达明显上调（P<0.001）；而相比于模型组，补肾活血汤组、LY组与补肾活血汤+LY组Bax、Caspase-3表达明显下调（P<0.05,P<0.001,P<0.001），但3组间的差异无统计学意义（P>0.05）。

补肾活血汤干预后衰老C57小鼠听皮层PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况见图13。模型组小鼠听皮层p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达明显上调（P<0.01,P<0.001）；而相比于模型组，补肾活血汤组、LY组与补肾活血汤+LY组可明显下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达（P<0.01,P<0.001），但3组间的差异没有统计学意义（P>0.05）。

3、讨论

补肾活血汤是基于中医耳肾相关理论、在临床上能够有效治疗老年性聋的药物。为了研究补肾活血汤能否通过延缓听皮层的衰老来治疗老年性聋，我们通过网络药理学方法检索并筛选补肾活血汤中可透过血脑屏障的的活性成分和其对应的作用靶点，以及老年性聋相关基因，结果发现1 118个补肾活血汤与老年性聋的共同靶点。通过GO与KEGG富集分析进一步分析这些共同靶点，共获得2 599个GO词条与205条可能的信号通路。因此，我们有理由相信补肾活血汤可以通过多途径对中枢性老年性聋有治疗作用。通过PPI分析获得度值前10位的核心靶点，在这些核心靶点中，SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、CTNNB1和HDAC1参与了细胞凋亡途径，TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA和HSP90AA1参与了PI3K/AKT信号通路。我们推测，补肾活血汤可能通过调节PI3K/AKT信号通路和凋亡途径起到对听皮层细胞的保护作用，并在补肾活血汤治疗中枢性老年性聋中充当重要角色。值得注意的是，有研究[8]发现PI3K/AKT信号通路参与了细胞凋亡的调节，对此，我们进行了体内实验验证。

越来越多的研究[9,10]表明，细胞凋亡与阿尔兹海默症、帕金森等神经退行性疾病密切相关。也有证据[11]显示，听皮层细胞的凋亡是导致中枢性老年性聋的主要原因之一。Bax是Bcl2蛋白家族中的促凋亡蛋白之一，正常情况下，Bax与Bcl2相互作用，不具有促凋亡活性，而在线粒体介导的细胞凋亡内在通路中，胞浆中的Bax被激活并转移到线粒体，引起线粒体外膜通透性改变，随后引发一系列改变完成细胞程序性死亡的过程[12,13]。Caspase-3是一种半胱氨酸蛋白酶，其激活在神经元凋亡中起着重要的作用，是线粒体途径和死亡受体途径介导凋亡的共同终末剪切酶[14]。D-半乳糖诱导小鼠衰老后听力明显下降，并且在听皮层中发生细胞凋亡，伴随着Caspase-3的明显升高[15]。衰老小鼠听皮层中Bax、Caspase-3与细胞凋亡成正相关，抑制凋亡途径可延缓年龄相关性听力损失[16]。本研究的免疫荧光、TUNEL和WB结果显示，衰老听皮层组织中凋亡的神经细胞数量明显增加，并且Caspase-3、bax的表达增加。

PI3K/AKT信号通路与细胞生长、增殖密切相关，可被多种类型的细胞应激激活[17]，该通路也参与了听皮层的衰老过程。在D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型中观察到p-PI3K与p-AKT在听皮层内上调[18]。我们的研究结果与此前的研究一致，衰老小鼠听皮层PI3K/AKT信号通路被激活，使用补肾活血汤或PI3K抑制剂都能明显抑制PI3K/AKT信号通路。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是PI3K/AKT通路最重要的下游分子之一，受PI3K/AKT信号调节。mTOR的过度激活可加速衰老小鼠的听力损失，导致听皮层细胞凋亡的增加[19]，而注射mTOR抑制剂雷帕霉素可以对大脑皮层神经元起保护作用，预防老年性聋[20]。最近研究[21]表明，抑制PI3K/AKT/mTOR可延缓耳蜗毛细胞衰老。此外，PI3K/AKT信号通路还可通过调控下游的Bax和Caspase-3而调节细胞凋亡[22]。与此前的研究一致，本研究的TUNEL染色、免疫荧光和WB的结果均显示，衰老小鼠听皮层mTOR被激活，使用补肾活血汤或PI3K抑制剂都能明显抑制mTOR的激活，并明显降低衰老小鼠听皮层细胞凋亡相关蛋白的含量。这说明补肾活血汤对凋亡的抑制作用可能是通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用的。

综上所述，本研究通过对补肾活血汤进行网络药理学分析预测，发现补肾活血汤可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路与抑制细胞凋亡途径对听皮层衰老发挥治疗作用，提示补肾活血汤有望成为一种治疗中枢性老年性聋安全、有效的药物。然而，我们的研究并没有验证补肾活血汤的其他有效通路，有必要通过相关实验，进一步探索补肾活血汤治疗中枢性老年性聋的作用机制。

参考文献:

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[5]冯宝怡,董庭婷,郑晓飞,等不同月龄c57bl/6j小鼠耳蜗线粒体和nad+水平比较l.上海交通大学学报( 医学版 )2022 42/8)980-9861.

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基金资助:国家自然科学基金项目(81403439);河南省科技攻关计划项目(222102310604); 河南省中医药科学研究专项重点课题(20-21zy1045);河南省高等学校重点科研项目(23a360028);

文章来源:周颖东,张梦娴,王青玲等.基于网络药理学和实验验证探讨补肾活血汤治疗中枢性老年性聋的机制[j].中药新药与临床药理,2023,34(10):1398-1408.