慢性阻塞性肺疾病(COPD)简称慢阻肺，是以慢性炎症、反复呼吸道症状及持续不可逆的气流受限(FEV1/FVC<70%)为主要特征的常见慢性呼吸系统疾病[1,2]。包括烟草、污染燃料、化学粉尘、感染、肺部发育、哮喘、遗传易感性与高气道反应等因素及炎症-免疫机制、氧化应激损伤、抗蛋白酶失衡等主要机制被认为是诱发COPD的常见危险因素和主要病理机制[3,4]。近年来COPD的发病率、复发率以及死亡率不断增加，已成为重大全球公共卫生问题[5]。据调查，全球40岁以上的COPD患病率已达5%～19%[6]。预计到2030年，COPD将成为全球病死率第三的慢性病[7]。同时，慢性阻塞性肺疾病全球创议预计在未来40年COPD的发病率仍会持续上升，且每年将有超过540万人死于COPD及其相关疾病[8]。目前，现代医学基础治疗主要以舒张支气管、抗炎为主，但仍无法治愈且不良反应大。中医学认为COPD属“肺胀”“喘证”“咳嗽”范畴。中医病机可概括为“虚”“痰”“瘀”“热”[9]。其特点为本虚标实，虚实夹杂，本虚以气阳虚(元气、宗气、卫气)为关键，标实以痰瘀阻肺为主，是导致气道阻塞的病理基础[10]。近年来，随着中医药的发展，中草药内含有多种成分及多个靶点，可以通过多条通路治疗疾病是中医药的独特优势，研究表明宣肺止嗽合剂能够特异性地影响炎症、氧化应激、细胞凋亡及支气管平滑肌等。因此在防治COPD过程中具有重要地位。

宣肺止嗽合剂是《中华人民共和国药典》收载的具有宣肺化痰止咳之功效。处方以荆芥、前胡为君药；陈皮、紫菀、百部、桔梗为臣药；鱼腥草、薄荷、罂粟壳为佐药；甘草引药入经为使药。诸药配伍升降有度、温而不燥、润而不腻，主治风邪犯肺之证，临床运用广泛。研究证明宣肺止嗽合剂可有效用于COPD的治疗，可减轻炎症反应，改善症状，提高肺功能[11]。方中陈皮、百部、甘草经现代药理学研究发现其挥发油可有效缓解支气管平滑肌痉挛，故而有宣肺止咳、理气化痰的作用；荆芥、鱼腥草中的提取物具有抗炎的作用，能够有效抑制炎症因子的合成和释放[12,13,14,15]。故运用网络药理学方法，系统分析宣肺止嗽合剂治疗COPD的可能活性成分和潜在分子相互作用机制，以期为宣肺止嗽合剂治疗COPD的药理研究和临床治疗提供科学依据。

1、资料与方法

1.1 宣肺止嗽合剂化学成分获取及靶点整理

以化合物的口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18为筛选条件在中药系统药理学数据库TCMSP搜索宣肺止嗽合剂(荆芥、前胡、桔梗、百部、紫菀、陈皮、鱼腥草、薄荷、罂粟壳、甘草)有效成分及对应靶点[16];在中药百科全书数据库ETCM中获取各单味药物化学成分及对应靶点。

通过UniProt数据库将所有靶点标准化，获取UniProt ID。

1.2 COPD靶点及交集靶点的获取

在PharmGkb数据库、GeneCards数据库、TTD数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库中以“Chronic obstructive pulmonary disease”为关键词检索与疾病相关的靶点基因，去重即可得到COPD相关靶点基因；使用R4.2.0软件制作韦恩(Venn)图并获取药物-疾病交集靶点；Cytoscape 3.8.0软件构建宣肺止嗽合剂药物成分靶点网络图。

1.3 蛋白质相互关系(PPI)网络构建及核心靶点筛选

将前序所得交集靶点导入STRING数据库，限定物种为“Homo sapiens”,评分条件>0.40,剔除游离节点，以构建PPI网络；再次通过Cytoscape 3.8.0软件中Analyze Network插件计算Degree(节点度值),进行网络拓扑学分析；Degree值大小与靶点关键性相关，其值越大说明该靶点越关键。

1.4 宣肺止嗽合剂关键活性成分获取

将上一步获得的核心靶点与其对应的350个活性成分，构建宣肺止嗽合剂治疗COPD的核心靶点-活性成分网络。若中药成分作用于5个及以上的靶点，推测为中药治疗COPD的关键活性成分。

1.5 交集靶点的GO生物过程和KEGG通路富集分析

将药物-疾病交集靶点导入R4.2.0软件，按“P<0.05,GO显示前30条，KEGG显示前20条”为筛选条件，进行GO和KEGG富集，运用微生信平台对结果进行可视化，可得宣肺止嗽合剂治疗COPD的主要生物过程和信号通路，并绘制核心靶点与通路的弦图。

1.6 关键活性成分和核心靶点分子对接验证

通过核心靶点与关键活性成分的分子对接来验证两者之间的结合性能。利用PubChem、PDB数据库获取对接的小分子配体和受体3D结构。运用AutoDock Tools 1.5.6对受体分子进行加氢，通过AutoDock Vina进行分子对接，最后采用PyMOL软件对选定结果进行可视化。

2、结果

2.1 宣肺止嗽合剂活性成分及靶点

将TCMSP和ETCM两个数据库获得的中药有效活性成分及对应的靶点去重后，共获取宣肺止嗽合剂有效活性成分370个及潜在靶点920个。

2.2 COPD潜在靶点

DrugBank、GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD数据库分别获取疾病靶点105、392、578、841、37个，去重后共获得COPD靶点1 843个。

2.3 药物-疾病交集靶点

将去重后所有COPD靶点与宣肺止嗽合剂靶点通过R4.2.0软件做Venn图取交集，得到药物-疾病交集靶点92个。其Venn图见图1。

图1靶点收集筛选Venn图  

2.4 药物-有效活性成分-共同靶点网络分析

将宣肺止嗽合剂10种单味药，370个有效活性成分，92个交集靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中构建宣肺止嗽合剂药物-成分-靶点网络，见图2,有485个节点，1 985条边。在此网络中，六边形表示药物对应的有效活性成分，以不同颜色区分，菱形表示交集靶点基因，表明宣肺止嗽合剂中不同有效化合物可作用于相同靶点，同一有效化合物亦可在不同靶点发挥作用，证实该药通过多成分、多靶点干预COPD的作用模式。

图2宣肺止嗽合剂治疗COPD的药物-有效成分-共有靶点网络  

2.5 PPI网络图构建及可视化分析确定核心靶点

通过STRING数据库得到PPI网络，见图3,共92个节点，816条边。使用Cytoscape 3.8.0软件中Analyzer Network插件进行可视化分析，经拓扑分析得出肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、趋化因子配体8(CXCL8)、过氧化物合酶2(PTGS2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、人内源性肌动蛋白(ACTB)为核心靶点，说明这8个基因在蛋白互作中发挥重要作用，见图4。

图3宣肺止嗽合剂-疾病-交集靶点PPI网络  

图4宣肺止嗽合剂治疗COPD核心靶点PPI网络  

2.6 宣肺止嗽合剂关键活性成分获取

针对8个核心靶点及对应的350个中药成分利用Cytoscape 3.8.0软件构建宣肺止嗽合剂治疗COPD核心靶点、中药成分网络图，见图5,经去重后有2种活性成分可作用于5个及以上的靶点，推测这2种活性成分为中药治疗COPD的关键活性成分，分别为木犀草素(Luteolin)和槲皮素(Quercetin),详见表1。

2.7 GO和KEGG富集分析

GO富集结果获取1 900条生物学过程，见图6。其中生物过程(BP)1 747条、细胞组分(CC)39条、分子功能(MF)110条。其中从高到低依次为氧化应激反应、脂多糖反应、对细菌来源的分子反应、细胞对化学应激反应、活性氧代谢过程、细胞对氧化应激反应等生物过程；有富含-1-颗粒、膜筏、膜微域等细胞组分；有G蛋白-偶联神经递质受体活性、血红素结合、乙酰胆碱受体活性等分子功能。

表1宣肺止嗽合剂核心活性成分信息

KEGG富集分析得到158条通路，见图7。主要信号通路为Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、结核、百日咳等，宣肺止嗽合剂治疗COPD的核心靶点与主要信号通路直接相关，见图8。提示宣肺止嗽合剂可能通过以上通路起到干预COPD的作用。

图5宣肺止嗽合剂治疗COPD核心靶点-中药成分网络  

图6宣肺止嗽合剂治疗COPD潜在靶点GO富集分析  

图7宣肺止嗽合剂治疗COPD潜在靶点KEGG通路富集分析  

2.8 宣肺止嗽合剂主要活性成分与核心靶点的分子对接

借助分子对接技术对宣肺止嗽合剂治疗COPD的网络药理学结果进一步验证，以结合能≤-5.0 kJ/mol为优对关键活性成分与核心靶点进行分子对接，其中TNF、CXCL8、IL6及IL-1βDegree值较高，经查阅文献的上述靶点与COPD密切相关。分别与其2个关键活性成分进行分子对接，结果利用微生信平台绘制最低结合能聚类热图，结合能均小于-5.0 kJ/mol,有较好的结合能力，见图9、表2。其中木犀草素与IL-1β、CXCL8具有最强结合能力，槲皮素与TNF、IL-6具有最强结合能力。木犀草素与IL-1β在ASN-7、SER-43、LEU-67、LEU-62、ASN-66、TYR-68处形成氢键；木犀草素与CXCL8在TYR-13、LYS-23、ASP-45处形成氢键；槲皮素与TNF在GLU-116、PRO-100、GLU-104、ARG-103、SER-99处形成氢键；槲皮素与IL-6在SER-122、THR-125处形成氢键，见图10。上述结果证实宣肺止嗽合剂关键活性成分与COPD的核心靶点具有较好的结合能力。

图8核心靶点与主要信号通路关系  

表2有效成分与核心基因分子对接

3、讨论

3.1 COPD发病机制

COPD是近几年来备受全球关注的慢性呼吸系统疾病之一，其发病机制比较复杂。相关研究显示，炎症反应、氧化应激反应与COPD的易感性、病情发展、肺功能下降关联密切[17,18]。机体长期暴露于各种外界致病环境因素下将会激活高活性分子而导致氧化应激反应，促使炎症细胞(中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞)渗出并分泌大量炎症介质，如IL-17、TNF-α、IL-6、IL-8等。IL-17主要来源于辅助性T细胞17(Th17),通过刺激巨噬细胞促进IL-6、IL-8释放，使黏液分泌增多，进而产生炎症反应[19],COPD程度越严重，IL-17增高越显著[20];研究表明，COPD患者氧化应激反应与疾病的严重程度呈正相关[21]。氧化剂通过激活NF-κB通路使IL-17、TNF-α、IL-8等分泌增多，上述一系列病理机制会促进炎症反应增加，最终导致COPD发生。

图9宣肺止嗽合剂治疗COPD的核心靶点与关键活性成分最低结合能聚类热图  

图10宣肺止嗽合剂治疗COPD的关键活性成分和相关核心靶点分子对接 

3.2 宣肺止嗽合剂治疗COPD的研究基础

宣肺止嗽合剂已被广泛应用于COPD的治疗。肖舒心等[11]研究表明，宣肺止嗽合剂治疗COPD患者可有效降低患者TNF-α、IL-8水平，提高血清IL-10水平。IL-8、TNF-α能够促进呼吸道炎症反应，引起肺组织氧化应激，损伤肺血管[22]。而IL-10能够抑制炎症介质的合成与释放，发挥抗炎与免疫抑制的作用[23]。提示宣肺止嗽合剂可减轻COPD患者炎症反应及氧化应激反应，改善肺功能，提高治疗效果。蒋婷等[24]研究表明，宣肺止嗽合剂可有效改善COPD合并急性加重期呼吸衰竭患者肺功能和血气指标，缓解临床症状，值得临床推广使用。

3.3 宣肺止嗽合剂关键活性成分作用机制

通过分析得出，宣肺止嗽合剂治疗COPD的关键活性成分为槲皮素、木犀草素。相关研究证明槲皮素具有明显的抗炎、抗氧化活性、抗菌的作用[25,26,27]。魏萍等[28]研究发现，槲皮素通过降低TNF-α等基因表达来抑制肺泡细胞凋亡，从而降低炎症因子的释放，缓解肺部炎症反应。木犀草素也被证实具有明显的抗氧化及抗炎的作用[29]。CHEN等[30]通过小鼠实验研究表明，动物样本经木犀草素处理过后能够控制脂多糖对小鼠肺泡-巨噬细胞(MH-S)的刺激作用，从而有效减少TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，以减轻炎症反应。综上，宣肺止嗽合剂治疗COPD可能通过槲皮素、木犀草素以发挥抗炎、抗氧化作用。

3.4 宣肺止嗽合剂治疗COPD的靶点分析

由PPI网络分析得出核心靶点为TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8等。IL-6和TNF是连接炎症和肿瘤的重要因子[31],IL-6通过刺激炎症细胞增殖和分化诱导机体释放多种炎性介质，从而加重肺部炎症反应[32];TNF是IL-8合成和释放的诱导剂。其中TNF-α是参与气道炎症反应的重要的炎症和免疫反应介质[33],已有研究证明，较高表达水平的TNF-α与炎症反应密切相关，该过程在COPD的形成机制中占据重要地位[10]。IL-1β是IL-1家族中参与先天免疫的重要促炎细胞因子，可参与调节多种炎症反应。相关研究发现，IL-1β在COPD患者肺内的水平以及诱导痰的能力明显高于从不吸烟者，表明IL-1β在COPD的发生发展以及相关烟雾引起的炎症过程中为重要介质[34]。相关研究表明，香烟烟雾能够使气道上皮细胞分泌的CXCL8增加，从而诱导中性粒和巨噬细胞引起气道炎症，反复的炎症反应加重气流受限[35,36,37]。由此推测宣肺止嗽合剂可能是通过TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8等靶点发挥抗炎以及抗氧化作用来干预COPD,但仍需后期实验进行验证。

3.5 宣肺止嗽合剂治疗COPD生物富集及通路富集结果分析

GO生物富集结果主要为氧化应激反应、脂多糖反应、对细菌来源的分子反应、细胞对化学应激反应、活性氧代谢过程、细胞对氧化应激反应等生物过程。氧化应激反应是COPD的重要病理过程，研究指出，氧化应激反应可能对COPD患者有放大炎症的作用[38],尤其是在COPD急性加重期患者体内会更明显[39]。COPD患者体内过氧化氢等氧化应激生物标志物浓度高于常人，机体在内外源性有害因子的刺激下会发生氧化应激反应，产生大量自由基使体内氧化-抗氧化失衡，该过程不仅可直接损伤肺部，同时也增加肺内多种炎症因子过度表达，引起抗蛋白酶氧化失衡，使黏液分泌增加[40]。上述论据同时证实氧化应激反应除自身对COPD发展的影响外，还通过引起、放大炎症反应来诱发疾病。而本研究结果证实宣肺止咳合剂治疗COPD的主要生物富集为氧化应激反应，提示宣肺止嗽合剂可以通过改变氧化应激及炎症反应来治疗COPD。

KEGG通路富集结果显示，治疗COPD的主要通路为Toll-样受体信号通路、IL-17信号通路和TNF信号通路等。研究表明IL-17信号通路和TNF信号通路为经典的炎症反应信号通路，与COPD密切相关。IL-17主要由Th17细胞产生，是一种二聚体糖蛋白，能够调节中性粒细胞生成以及募集到炎症位点，引起炎症反应[41,42]。TNF作为重要的炎症细胞因子，在此信号通路上参与炎症及氧化应激过程[43]。此外，Toll样受体是一种抵御各种病原体入侵的第一道天然防线，参与机体的各种炎症反应、免疫应答及细胞凋亡。当香烟烟雾或者其他细菌等吸入气道后，Toll样受体继而会产生一系列病理生理改变，参与COPD的整个病程中[44]。综上所述，结合研究结果推测宣肺止嗽合剂治疗COPD可能通过上述通路发挥抗炎及抗氧化应激的作用。

4、结语

当前基于宣肺止嗽合剂干预COPD的研究只针对单一成分、单一通路。通过网络药理学方法构建宣肺止嗽合剂所有药物成分-COPD-靶点关系，预测宣肺止嗽合剂中槲皮素、木犀草素可有效作用于TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8等多个核心靶点，通过Toll样受体、IL-17和TNF信号通路相互作用发挥抗炎及抗氧化应激作用，发挥多成分、多靶点、多通路的网络途径治疗COPD,同时通过分子对接技术对此进行验证。弥补宣肺止嗽合剂整方作用COPD的关键成分、靶点、生物过程及相关通路，以期为后续基础研究、探讨提供思路。后续将通过体内、外实验对本研究结果进行更详尽的基础机制验证，明确作用机制，为该药更有针对性的临床应用对症治疗提出较为充分的理论依据及合理建议。

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文章来源:史艳丽,王云超,林翱等.基于网络药理学及分子对接探讨宣肺止嗽合剂治疗COPD潜在机制[J].亚太传统医药,2024,20(02):108-115.