慢性疲劳综合征（chronic fatigue syndrome,CFS）是以明显疲劳感、睡眠障碍、认知障碍、注意力不集中和头痛等一个或多个症状为主要表现的一类疾病，全球患病率为0.4%～1%[1]。目前西医对CFS采用对症治疗，疗效欠理想。仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb.又名脱力草、大力草，民间常用于缓解疲劳[2,3]，有文献报道，仙鹤草对动物运动性疲劳有治疗作用[4,5,6,7]，但其缓解疲劳的有效成分和作用机制尚未明确。本研究采用网络药理学方法，探讨仙鹤草治疗CFS的有效成分及作用机制。

1、资料与方法

1.1 仙鹤草化学成分及靶点获取

在Sym Map数据库收集仙鹤草化学成分，以口服生物利用度（OB)>30%，分子量<500，氢键供体数≤5，氢键受体数<10为条件筛选[8]。在HERB数据库选择“Ingredient”，分别以筛选后的化学成分为关键词进行检索，得到化学成分对应靶点信息，进行整理去重。

1.2 疾病靶点收集

在Dis Ge NET数据库以“Chronic Fatigue Syndrome”为关键词进行检索，得到CFS相关靶点。

1.3 仙鹤草治疗慢性疲劳综合征靶点获取

将收集的成分靶点和CFS靶点导入Venny2.1.0，对二者取交集，交集靶点即为仙鹤草治疗CFS的潜在靶点。

1.4 仙鹤草-化学成分-交集靶点网络构建

将筛选得到的仙鹤草化学成分和治疗CFS靶点导入Cytoscape3.9.1软件，构建仙鹤草-化学成分-交集靶点网络。

1.5 蛋白相互作用网络构建

利用Uni Prot数据库（将交集靶点转换为基因名称，将交集靶点导入STRING数据库，获得蛋白相互作用（PPI）网络，并将结果导入Cytoscape3.9.1软件可视化。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库，物种选择“人”，进行GO和KEGG通路分析。根据P值降序排列，结果利用微生信平台进行可视化处理。

1.7 分子对接验证

根据以上分析结果，以度值排名前4位化学成分为配体，核心基因对应蛋白为受体，利用CB-Dock平台进行分子对接。在Pub Chem数据库获取配体的2D结构，在Alpha Fold数据库获取靶点蛋白3D结构。对接结合能<-5 kcal/mol表明受体与配体可自发结合。

2、结果

2.1 仙鹤草化学成分及作用靶点

通过Sym Map数据库收集仙鹤草化学成分79个，筛选后共得到21个。包括Luteolin（木犀草素）、1,8-Cineole(1,8-桉油醇）、Beta-Sitosterol(Beta-谷甾醇）、Kaempferol（山柰酚）、Osthol（蛇床子素）、Patchouli Alcohol（百秋李醇）、Ellagic Acid（鞣花酸）、Thymol（麝香草酚）、3,4,5-Trihydroxybenzoic Acid (3,4,5-没食子酸）、Ellipticine（玫瑰树碱）、D-Camphene（樟脑萜）、(L)-Alpha-Terpineol ((L)-Alpha-松油醇）、(-)-Alpha-Pinene ((-)-Alpha-蒎烯）、(-)-Nopinene((-)-Beta-蒎烯）、(R)-Linalool((R)-芳樟醇）、L-Limonen(L-柠檬烯）、(-)-AlphaCedrene((-)-Alpha-柏木烯）、(-)-Bornyl Acetate（(-)-乙酸冰片酯）、Cedryl Acetate（乙酸柏木酯）、R-3-Hydroxy-Butanoic Acid((R)-3-羟基丁酸）、Quercetin（槲皮素）。在HERB数据库获得360个潜在靶点。

2.2 疾病靶点

在Dis Ge NET数据库得到CFS相关靶点118个。

2.3 交集靶点

将仙鹤草化学成分的360个潜在靶点与118个CFS相关靶点导入Venny2.1.0取交集，得到22个仙鹤草治疗CFS的可能靶点，分别为IL2、IL6、IL10、NOS2、PTGS2、TNF、ESR2、TGFB1、NR3C1、SLC6A4、CFB、ELANE、NFE2L2、PLAU、MASP2、MUC1、NLRP3、TRPA1、PTK2B、IL1A、IL1B、SULT1E1。

2.4 仙鹤草-化学成分-交集靶点网络

将仙鹤草、21个化学成分及22个交集靶点信息导入Cytoscape3.9.1软件构建仙鹤草-化学成分-交集靶点网络（见图1），共包含44个节点、69条边。利用Network Analyzer插件计算各靶点度值，最大为17，最小为1，平均值3.14，度值>3.14的靶点有PTGS2、NOS2、ESR2、TNF，度值分别为17、10、8、6；化学成分靶点度值最大为13，最小为0，平均值3.28，度值>3.28的成分见表1。

2.5 蛋白相互作用网络

将22个交集靶点导入STRING数据库，得到交集靶点PPI网络（见图2）。使用Cytoscape3.9.1软件进一步分析得到交集靶点相互作用关系（见图3），图中颜色越深表示度值越大，由图3可知，IL6、IL1B、TNF、PTGS2等靶点发挥主要作用。

图1 仙鹤草-化学成分-交集靶点网络  

表1 仙鹤草治疗CFS主要成分（度值>3.28)  

图2 仙鹤草治疗CFS靶点PPI网络   

图3 仙鹤草治疗CFS靶点相互作用关系   

2.6 GO功能和KTGG通路分析结果

GO分析结果显示，仙鹤草治疗CFS涉及181个生物过程（BP),9个细胞组分（CC）和10个分子功能（MF）。以P<0.01筛选后，见图4。炎症应答、对缺氧的应答、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、白细胞介素-8产生的正调控、促进平滑肌细胞增殖等生物过程，胞外间隙、胞外区、细胞膜、分泌颗粒等细胞组分及细胞因子活性、生长因子活性、甾体结合等分子功能在仙鹤草抗CFS过程中发挥重要作用。

KEGG分析结果显示，仙鹤草治疗CFS涉及58条通路。按P值升序排列，选取20条通路作图，见图5。细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、C型凝集素受体作用、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路及免疫相关通路在仙鹤草治疗CFS中发挥重要作用。

图4 仙鹤草治疗CFS靶点GO富集分析条图  

图5 仙鹤草治疗CFS靶点KEGG通路富集分析气泡图   

2.7 分子对接结果

选取4个度值较高的化学成分（槲皮素、蛇床子素、木犀草素、β-谷甾醇）与4个度值较高的靶点（IL1B、IL6、TNF、PTGS2）进行分子对接，对接结果见表2。结果显示，各成分与靶点的分子对接结合能均小于-5 kcal/mol，表明关键成分与核心靶点能自发结合。4个成分与PTGS2结合能较低，提示PTGS2可能是仙鹤草治疗CFS的重要靶点。  

表2 分子对接验证结果（kcal/mol)  

3、讨论

仙鹤草首载于《神农本草经》，早期以根部入药，形态似牙，故名“牙子”“狼牙”等[9]，《千金方》载其草、叶和根均可入药[10]。仙鹤草之名首见于《伪药条辨》[11]。仙鹤草基原植物为蔷薇科龙芽草属植物龙牙草Agrimonia pilosa Ledeb.的干燥地上部分，夏、秋二季茎叶茂盛时采割[12]。仙鹤草的地下冬芽被称为鹤草芽。研究表明，仙鹤草含100多种次级代谢产物，可分为类黄酮、异香豆素、三萜、间苯三酚衍生物、单宁和有机酸等[13]，有抗肿瘤、止血、降血糖、抗炎、抗菌、杀虫、镇痛等作用，可治疗肿瘤、滴虫病、阴道炎、腹泻和痢疾等疾病[14]。

1985年版及之后的《中华人民共和国药典》均记载仙鹤草可治疗脱力劳伤[12]。然而以“仙鹤草”及其别名“牙子”“狼牙”“狼牙草”“龙牙草”“黄龙尾”“金顶龙牙”“过路黄”“刀口药”等考古代本草，并无仙鹤草用于脱力劳伤的记载。《滇南本草》记载“面寒腹痛”已相对接近。故仙鹤草治疗脱力劳伤的作用应是基于民间应用而被《中华人民共和国药典》收录。以仙鹤草治疗疲劳在南方应用较多。南京中医药大学干祖望教授提到，“我乡民间，凡人精神不振，四肢无力，疲劳怠惰，或重劳动之后的困乏……土语称‘脱力’，于是到药铺抓一包脱力草（不计份量的）加赤砂（即红糖，也不拘多少）浓煎两次，服用。一般轻者1～2剂，重者3～4剂，必能恢复精神”[2]。其他研究者亦有关于仙鹤草治疗神经衰弱、嗜睡、低血压、肿瘤、产后虚寒等的报道[15]。仙鹤草可与党参、太子参、黄芪、百合等组成仙人饮用于CFS治疗[3]，也可以和仙茅、淫羊藿组成三仙汤，用于无外邪的各类疲乏[2]。根据笔者临床体会，临床应用仙鹤草多以30 g以上水煎入药，也可用至100 g左右，其治疗疾病多以虚证为主的各类疲乏如虚劳等，也可用于过度劳累和癌症患者疲劳，多数患者符合CFS的西医诊断标准。目前文献报道仙鹤草抗疲劳的实验研究主要集中在对运动性疲劳的作用，其机制可能与抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴兴奋性[16]、抗缺氧[4]、抗心肌氧化应激损伤[6]等有关。

CFS主要症状包括不明原因的强烈的全身乏力，同时可能伴有低热、咽痛、淋巴结痛、头痛、肌肉痛、关节痛和精神神经等症状，持续6个月以上，即使充分休息也难以消除，常反复发作[17]。CFS病理机制尚不完全清楚。抗原持续刺激理论认为，由于抗原持续对机体产生刺激，从而使机体产生长期、恒定的免疫反应，这些免疫反应导致CFS抗原消除后仍持续发生，从而使得炎症递质及细胞因子，如白细胞介素（IL）、干扰素等保持在较高水平，进而引发CFS[17]。由于CFS患者临床上具有流感症状，如发热、头疼、淋巴结疼痛等，并表现出突发性和流行性，很多研究者认为CFS可能是由病毒感染引起[17,18]。另外，也有不少学者认为，CFS与神经内分泌系统紊乱、营养代谢异常及不良生活习惯相关[17,19,20,21]。中医认为，CFS与“倦怠”“乏力”“怠惰”“体重”“四肢不用”等症状较接近，可见于郁证、失眠、虚劳等病证。

本研究筛选得到仙鹤草治疗CFS化学成分21个，包括木犀草素、β-谷甾醇、蛇床子素、山柰酚、鞣花酸、玫瑰树碱、(R)-芳樟醇、槲皮素等，作用靶点22个，包括TNF、ESR2、NOS2、PTGS2等。GO分析结果显示，仙鹤草治疗CFS涉及炎症应答、对缺氧的应答、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、白细胞介素-8产生的正调控、促进平滑肌细胞增殖等生物过程。KEGG分析结果显示，仙鹤草治疗CFS涉及58条信号通路，包括C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptors signaling pathway）、核因子-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptors signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等。分子对接验证结果表明，槲皮素、蛇床子素、木犀草素、β-谷甾醇与IL1B、IL6、TNF、PTGS2具有结合活性，其中PTGF2与4个成分结合活性相对较大。

在上述生物过程及信号通路中，炎症反应及免疫反应较多见，表明调节炎症和免疫可能是仙鹤草治疗CFS的重要作用途径。NF-κB属于转录因子蛋白家族，是介导免疫炎症反应的核心物质。TNF、IL-1β等细胞因子均可诱导NF-κB通路激活，NF-κB的激活又可诱导TNF-α、IL-1β、IL-6和C反应蛋白产生[22]，这些细胞因子是疲劳发生的重要因素[23]。C型凝集素受体和Toll样受体也可激活NF-κB信号通路[24,25]。NF-κB既可通过介导免疫炎症反应、调节中枢兴奋性和抑制性神经递质、调节突触可塑性和中枢神经系统功能基因抑制中枢疲劳，也可以通过调节p53、c-Myc、cyclin D1、Bc L-Xs、BAX和Fas配体等基因表达促进神经元凋亡[23,26]，诱导疲劳发生[27]。类黄酮B环3'和4'位置含羟基结构，使得很多黄酮和类黄酮类具有良好的抗炎特性[28]。仙鹤草中的黄酮类化合物如木犀草素、槲皮素等可直接抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7的NF-κB活化，从而抑制炎症发生[29]。仙鹤草水提物也可有效降低缺血再灌注损伤大鼠IL-1β、TNF蛋白表达[30]。据此推测，仙鹤草有效成分可能通过干预IL-1β、TNF等表达调控NF-κB通路，也可能直接作用于NF-κB通路，从而减弱细胞炎症反应和神经元的各种损伤因素，治疗CFS。

仙鹤草治疗CFS还涉及癌症通路。癌症患者常见疲劳，主要原因包括肿瘤细胞对中枢神经系统（炎症、下丘脑-垂体-肾上腺轴）和/或外周神经系统（如能量代谢降低）的潜在破坏[31]及癌症治疗药物的神经毒性作用[32]。研究表明，仙鹤草中的蛇床子素可作用于癌症通路，抑制各种癌细胞生长，其潜在作用机制包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、逆转多药耐药性及抑制癌细胞侵袭和迁移[33]。前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2）是介导前列腺素合成的关键酶之一，通常由炎症刺激诱导[34]。研究表明，PTGS2可成为多种癌症化学预防的新靶点。靶向PTGS2可有效缓解结肠癌及胃癌进展[34,35]，沉默PTGS2可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[36]。目前尚未见上述4个成分调控PTGS2的文献报道，后续可考虑进行研究。

仙鹤草治疗CFS的可能机制还包括1型糖尿病相关通路。糖尿病患者常见疲劳[37]，高血糖、低血糖和葡萄糖波动性均可导致疲劳发生[38]。β-谷甾醇是较常见的生物活性成分，也是一种高效的抗糖尿病药物。β-谷甾醇可通过下调IKKβ/NF-κB和JNK信号通路改善脂肪组织炎症，发挥抗糖尿病作用[39]。山柰酚也可调节脂质代谢、改善胰岛素抵抗以降低脂毒性，并且可改善胰岛素信号传导，恢复葡萄糖利用和产生之间的平衡[40]。

仙鹤草对Ig A产生的肠道免疫网络也值得关注。Ig A肠道免疫网络障碍是近年发现的CFS发病机制[18]。易感人群长期暴露于感染环境下，如痢疾、肠易激综合征等，可刺激机体产生自身反应性B细胞，并以记忆Ig M+、Ig A+或Ig G+B细胞形式保留在脾脏和淋巴结中，从而形成“自身抗体”，这些抗体会消耗能量代谢中的关键酶，导致能量代谢缺陷或蛋白质能量营养不良等类似CFS症状[18]。

综上所述，本研究采用网络药理学方法对仙鹤草治疗CFS的化学成分、靶点、生物过程及信号通路进行研究，研究结果表明，仙鹤草治疗CFS具有多成分、多靶点的特点，具体作用机制尚需进一步的实验验证。

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基金资助:国家自然科学基金(82004327､82104765);

文章来源:鲁昕怡,马重阳,王佳佳,等.基于网络药理学探讨仙鹤草治疗慢性疲劳综合征作用机制[J].中国中医药图书情报杂志,2024,48(04):47-53.