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柏苓化浊丸治疗炎症性疾病的网络药理学探讨

2024-08-01 298 上传者：管理员

摘要：本研究以国医大师林天东研制的院内制剂柏苓化浊丸为研究对象，运用网络药理学方法探究院内制剂柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症可能的作用机制。通过TCMSP数据库，从院内制剂柏苓化浊丸中筛选得到79个有效活性成分，551个疾病基因靶点，与前列腺炎相关疾病共同存有113个不重复相交集的靶点基因。院内制剂柏苓化浊丸主要分清浊，清湿热，其活性成涉及的核心靶点参与了介导免疫反应，通过与不同类别的细胞受体结合激活，控制包括基因转录、免疫反应、细胞粘附、细胞周期进程、细胞凋亡、迁移和转化在内的生物活性进程。因此，院内制剂柏苓化浊丸的网络药理学分析可为进一步深入研究柏苓化浊丸作用机理提供理论基础和科学依据，助推基于院内制剂柏苓化浊丸的创新药物开发。

关键词：
柏苓化浊丸
炎症因子
炎症性精液不液化症
网络药理学
院内制剂
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国医大师林天东教授在50余年的临床实践中发现通过运用清热利湿，化浊祛毒之法，自拟方柏苓化浊汤，在治疗精液不液化症以及生殖系感染临床效果显著，在有效改善精液液化情况的同时，对前列腺炎等炎症性疾病以及提升精液活力、妊娠率均有较好的疗效。该方自1975年应用于海南省中医院，已有40年之久，于2010年取得中药制剂批号，年使用人次数千人，临床疗效显著及未见不良反应出现。

前列腺发炎可导致精液中的前列腺液的液化因子含量下降，而精囊腺的凝固因子相对较多，使精液的凝固与液化的平衡协调关系被打破，发生液化延迟或不液化[1]。精液不液化症是男性常见病及多发病，在我国的发病率约占男性不育的2.51%～42.65%[2]。目前西药的治疗主要集中在抗炎、抗氧化和补充微量元素等经验性治疗上，且临床效果不佳，副作用较多，影响受孕率。

目前针对院内制剂柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症的研究，均集中于临床疗效的观察，柏苓化浊丸及其主要活性成分对炎症性精液不液化症的治疗作用机理均不明确。因此，本研究详细分析柏苓化浊丸的化学成分组成，结合网络药理学方法，对柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症的作用通路及抑制治疗机理进行研究，从宏观到微观的层面解析作用机理，通过构建网络模型来反映作用靶点及潜在机制。本项目的研究结果将为柏苓化浊丸安全合理应用于炎症性精液不液化症的治疗和进一步深入研究提供理论基础和科学依据。

1、实验方法

1.1柏苓化浊丸化学成分来源及靶点的预测

采用TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/)对柏苓化浊丸含有的中药材进行成分筛选及靶点收集，选用TCMSP数据库时将筛选条件设定为口服给药利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18，结合Lipinsk五原则及高肠胃道吸收性来筛选出有效的活性成分。对筛选出的活性成分应用PubChem数据库查询Smiles号，通过检索相关靶点数据库SwissTargetPrediction[3](https://www.swisstargetprediction.ch/)、ChEMBL[4](https://www.ebi.ac.uk/chembl/)构建柏苓化浊丸成分库。通过UniProt(http://www.uniprot.org)[5]数据库对靶点数据的基因名称进行标准化，仅保留人源(Homosapiens)靶点数据用于后续分析。

1.2靶点集合构建

依据GeneCards(https://www.genecards.org/)[6]、DisGeNet(https://www.disgenet.org/)[7]2个数据库对前列腺炎靶点基因进行检索。以“prostatitis”为关键词检索前列腺炎的疾病靶点，通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对基因名称进行标准化，为确保数据的可信度，采用高相关值(≥10.0)对靶点进行筛选，对两个数据库的结果进行混合重组，作为最终前列腺炎靶点信息。

1.3 Protein-proteininteraction网络构建与分析

将柏苓化浊丸调控的基因靶点与前列腺炎相关的疾病靶点进行相交靶点的筛选，得到柏苓化浊丸治疗前列腺炎的潜在作用靶点。而后将得到的靶点基因集合提交至STRING(https://cn.string-db.org/)[8]进行PPI网络的构建，选择Homosapiens作为目标物种，互作关系得分的阈值选取高可信度0.9，删除独立靶点。将所获得的PPI网络在Cytoscapev3.10.0中进行可视化，并进行DEGREE值计算排序，选取出值最高的前5位成分作为柏苓化浊丸调控前列腺炎的核心靶点。

1.4基因本体(GO)功能富集与KEGG通路富集分析

将柏苓化浊丸治疗前列腺炎的潜在靶点导入Metascape数据库[9](https://metascape.org/)、David[10](https://david.ncifcrf.gov/)数据库进行基因本体(GO)和KEGG通路富集分析，获取潜在靶点的生物学信息，并分析柏苓化浊丸治疗前列腺炎的潜在作用机制。其中基因本体(GO)部分分为：包括生物过程(Biologicalprocesses,BP)、细胞成分(Cellularcomponents,CC)和分子功能(Molecularfunctions,MF)[10]。

2、结果与讨论

2.1柏苓化浊丸化学成分来源及靶点谱集构建

经过相关数据库筛选，柏苓化浊丸共有活性成分79个。以“prostatitis”作为检索词，根据适配性对得到的相关疾病基因进行筛选，整合多个数据库的前列腺炎相关疾病基因，按筛选标准共得到551个不重复的基因靶点。

表1 BLHZP中关联度最高的前20个活性成分

2.2 Protein-proteininteraction网络构建与分析

79个柏苓化浊丸标准化成分与前列腺炎相关疾病共同存有113个不重复相交集的靶点基因，基于STRING蛋白质互作背景网络构建柏苓化浊丸治疗前列腺炎潜在靶点基因的PPI网络，选取高可信度0.9对网络构造进行优化。网络中含有具有相互作用的节点数112个，独立节点1个，421条边，平均节点度值为7.52，平均聚类分布系数0.54。根据富集分析显示，PPI富集p值<1.0×10e-16，能够显著富集。其中核心靶点前5位，分别为SRC、STAT3、AKT1、ESR1、HSP90AA1，这些靶点基因的功能各不相同，原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC为非受体蛋白酪氨酸激酶，在与许多不同类别的细胞受体结合后被激活，包括免疫反应受体、整联蛋白和其他粘附受体、受体蛋白酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体以及细胞因子受体。参与控制多种生物活性的信号通路，包括基因转录、免疫反应、细胞粘附、细胞周期进程、细胞凋亡、迁移和转化[11-12]。STAT3是信号转导器和转录激活剂，介导细胞对白细胞介素其他生长因子的反应，由IL31通过IL31RA激活一旦激活，介导细胞对激活的FGFR1～FGFR4的反应与IL-6反应元件结合，通过调节差异作为炎症反应的调节剂[13-14]。AKT1调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成在内的许多过程[15-16]。ESR1类固醇激素及其受体参与真核基因表达的调节并影响靶组织中的细胞增殖和分化[17]。HSP90AA1为分子伴侣，促进细胞周期控制和信号转导等特定靶蛋白的成熟、结构维持和适当调节[18-19]。

图1 113个交叉靶基因的PPI网络

2.3 GO富集与KEGG分析

图2 KEGG信号通路气泡图

为从更科学、更系统的角度诠释柏苓化浊丸治疗前列腺炎的作用机制。对113个柏苓化浊丸治疗前列腺炎的潜在作用靶点进行基因本体功能富集与KEGG通路富集分析。柏苓化浊丸成分富集显著的生物过程中，主要涉及对激素的反应(p=1.07×10-47)、腺体发育(p=5.12×10-39)等；细胞组分主要涉及膜筏(p=1.91×10-13)、转录调节复合物(p=6.76×10-13)等；分子功能方面，柏苓化浊丸主要涉及蛋白激酶活性(p=4.27×10-29)、转录因子结合(p=4.57×10-23)、蛋白激酶结合(p=2.04×10-22)等蛋白细胞活性方面。

在柏苓化浊丸中对于前列腺炎相关疾病具有显著富集的KEGG通路为：癌症发病通路Pathways in caner(p=1.86×10-75)、前列腺癌通路Prostate cancer(p=1.29×10-50)、流体剪应力与动脉粥样硬化通路Fluid shear stress and atherosclerosis(p=3.11×10-28)、p53信号通路p53 signaling pathway(p=1.02×10-18)等。SRC、STAT3、AKT1、ESR1、HSP90AA1等参与多条信号通路，在对于前列腺炎的控制、炎症反应的抑制上具有积极作用，这些靶点在多条治疗前列腺炎的信号通路间起到了连接的作用，从而使得柏苓化浊丸能够依靠大量存有这些节点的活性成分同时干预多条与前列腺炎感染相关的信号通路，体现出“多成分-多靶点-多通路”机制。

精液不液化病因病机复杂，结合古代文献、各大医家观点及临床实践，林天东教授认为伤于湿者，下先受之。湿为阴邪，其性重浊，黏滞难化，湿热夹杂，更灼伤津液。若饮食不节，平素喜食肥甘厚味、辛辣刺激之品，蕴生湿热，损伤中焦脾胃，脾失运化，更无法运化湿邪，或外感湿邪，久郁化热，湿热下注于精室，阻碍气机，熏蒸精室，伤阴耗津，致使精液黏稠不化。久之则化毒。湿毒相合易阻遏气机、损伤阳气，若气机不畅，则气化失常，使得精液难以液化；湿毒其性黏滞，致病后多缠绵难愈，久病致瘀，败精阻于精室，亦使精液不液化。

因此，研制的院内制剂柏苓化浊丸治疗精液不液化症，由黄柏、车前子、白茅根、土茯苓、龙胆草、石菖蒲、益母草、益智仁、茜草、乌药、苦参、萆薢、莲芯、茯苓、黄芩、赤芍相关药物组成。用于治疗湿热下注、浊毒内生型炎症性精液不液化症。方中黄柏、车前子为君，其性苦寒、具有清热利湿之功。萆薢、石菖蒲、益智仁三者功可清热利尿，补肾泄浊；土茯苓、苦参清热燥湿祛毒；龙胆草、白茅根清热利湿；黄芩、莲芯泻火；乌药通络，共为臣药。赤芍、益母草、茜草凉血活血祛瘀；茯苓健脾化湿和胃共为使药。诸药合用，使得清浊分，湿热去，脉络通，共奏清热利湿，祛毒排浊，活血化瘀之功，以助精液液化之能。

通过基因本体(GO)功能富集与KEGG通路富集分析结果显示柏苓化浊丸治疗前列腺炎的作用机制主要涉及癌症发病通路、前列腺癌通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等主要信号通路，在出现前列腺炎症状的过程时，生殖系统发生不同程度的损伤，如充血、肿胀等，引起微循环障碍及血液流变学异常。柏苓化浊丸治疗前列腺炎主要以清热祛湿、补肾泄浊为主，柏苓化浊丸活性成分涉及的核心靶点，参与了介导免疫反应，通过与不同类别的细胞受体结合激活，控制包括基因转录、免疫反应、细胞粘附、细胞周期进程、细胞凋亡、迁移和转化在内的生物活性进程。

3、结论

本文通过分析院内制剂柏苓化浊丸中各药味的化学成分组成，结合网络药理学方法，对院内制剂柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症进行研究，从微观的角度阐述柏苓化浊丸的作用机理，通过构建网络模型来反映作用靶点及潜在机制，阐明药物、疾病、靶点和通路之间的复杂关系。根据院内制剂柏苓化浊丸包含的中药材成分共检索到有效活性成分79个，与前列腺炎相关疾病基因交集靶点共551个。经过筛选得到了与疾病关系最为密切的SRC、STAT3、AKT1、ESR1、HSP90AA1五个核心靶点，并结合基因本体功能富集与KEGG通路富集分析从多个角度探讨院内制剂柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症的潜在分子机制。

综上，基于网络药理学对院内制剂柏苓化浊丸治疗炎症性精液不液化症进行挖掘并分析，结果表明院内制剂柏苓化浊丸活性成分与SRC、STAT3、AKT1、ESR1、HSP90AA1等基因靶点介入前列腺癌通路、流体剪应力与动脉粥样硬化通路、p53信号通路等发挥治疗炎症性精液不液化症的作用，阐明了院内制剂柏苓化浊丸干预调控炎症性精液不液化症的分子作用机制，助推基于院内制剂柏苓化浊丸的创新药物开发。

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基金资助:海南省自然科学基金青年基金项目(820QN407);海南省自然科学基金高层次人才项目(821RC720);国家中医药管理局第四届国医大师传承工作室建设项目;