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组氨酸含量对细菌回复突变试验背景值的影响

2025-02-12 69 上传者：管理员

摘要：目的研究不同试验体系中组氨酸含量对鼠伤寒沙门氏菌回复突变菌落数背景值的影响。方法选择药品和食品安全性评价中常用的鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA1535和TA1537，分别在非代谢活化和代谢活化条件下开展基于6孔板（mini-Ames试验，组氨酸浓度范围为0.03～1mg/m L）和标准平皿Ames试验（组氨酸浓度范围为0.01～0.5 mg/m L）。结果 Mini-Ames试验中组氨酸浓度在0.2～0.3mg/m L范围内时，TA98、TA100和TA1535在无或有S9条件下的回复菌落数与溶媒对照组相比增加2倍或3倍以上，呈阳性结果。标准平皿Ames试验中无或有S9条件下所有菌株结果均为阴性。此外，无或有S9时，组氨酸浓度在0.5 mg/m L及以上时菌株菌落数减少且使背景菌苔增厚。结论与标准平皿Ames试验相比，mini-Ames试验易于出现阳性结果。组氨酸浓度范围在0.2～0.3 mg/m L时可影响细菌回复突变试验背景值，且高浓度组氨酸对菌株存在明显细菌毒性。因此有必要测定受试物中组氨酸含量或增加适宜的对照组，保证研究结果准确性。

关键词：
假阳性
组氨酸
细菌回复突变试验
背景值
致突变性
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细菌回复突变试验由Ames于1975年建立,因此也称为Ames试验,是一项检测基因突变的体外致突变性试验｡该试验的原理是利用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株,在可诱导碱基突变的化合物作用下通过发生回复突变,从而自行合成组氨酸来形成大量肉眼可见的菌落,通过菌落计数来评价受试物的碱基突变能力｡细菌回复突变试验对大鼠致癌物和恒河猴致癌物的检出率分别为69.0%和87.5%,是当前所有遗传毒性评价方法中对致癌物预测度最高的试验[1-2]｡Ames试验周期短､方法相对简单､结果直观明了,被广泛用于药物､食品､化学品和农药的遗传毒性检测,评价其潜在人体致突变性风险｡

因试验方法涉及特殊的组氨酸缺陷型沙门氏菌,受试物中含有组氨酸成分可能对菌落计数结果产生干扰,从而影响结果的评判｡如某些中药､食品原料或生物材料中含有游离组氨酸以及以二肽形式存在的组氨酸,可能导致其背景菌落数增加,造成“假阳性”结果[3]｡受试物中的组氨酸可使用多种吸附剂和溶剂来去除,然而吸附剂和溶剂易于与受试物相互作用｡尽管添加组氨酸脱羧酶也有助于去除游离组氨酸,但当组氨酸的羧基位于肽链中或在二肽或异二肽时,组氨酸脱羧酶则无法促使组氨酸脱羧[4]｡因此,大多数情况下受试物中的组氨酸成分无法完全去除,有必要了解不同浓度组氨酸对不同菌株背景菌落数的干扰程度,从而获知受试物中组氨酸含量是否对Ames试验结果判断产生影响｡本研究选择药品和食品安全性评价中常用的鼠伤寒沙门氏菌TA97a､TA98､TA100､TA1535和TA1537,分别在非代谢活化和代谢活化条件下开展基于6孔板(mini-Ames试验)和标准平皿的Ames试验,研究试验体系中添加不同含量的组氨酸对各菌株回复突变菌落数及背景值的影响,为Ames试验中含有游离组氨酸的样品提供组氨酸的含量或浓度限定｡

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型(his-)菌株TA97a､TA98､TA100､TA1535和TA1537引自日本(株)生物科学中心(JBSINC),经分离筛选后对其是否存在氨基酸及生物素合成缺陷､细胞壁脂多糖缺失(rfa)､紫外线(uvrA或△uvrB)修复缺陷､抗氨苄青霉素及抗四环素(含pKM101或pAQ1质粒)等特性进行鉴定,鉴定结果符合要求后用于试验｡

1.1.2试剂及仪器受试物组氨酸购自美国SigmaAldrich公司;溶媒灭菌注射用水购自北京华夏生生药业有限公司;2-2-(呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺(2-2-furyl-3-5-nitro-2-furylacrylamide,AF-2)､2-氨基蒽(2-aminoanthracene,2-AA)､苯并芘(benzoapyrene,B(a)P)､琼脂粉､葡萄糖购自北京索莱宝科技有限公司;色氨酸､生物素､烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)､G-6-P均购自美国Sigma公司;叠氮钠(NaN3)购自美国Merck公司;9-氨基吖啶(9-aminoacridine,9-AA)购自比利时AcrosOrganics公司;营养肉汤No.2购自英国Oxoid公司;MgSO4·7H2O､C6H5Na3O7·2H2O､K2HPO4·3H2O､KH2PO4､(NH4)2SO4､KCl､MgCl2均购自国药集团;SD大鼠肝S9购自北京安宝迪科技有限公司(由多氯联苯诱导大鼠肝脏制成)｡

HeracellVIOS160i二氧化碳培养箱购自美国ThermoFisher公司;NU-543-400S生物安全柜购自美国Nuaire公司;MIR-253恒温培养箱购自日本三洋公司;CKX31倒置显微镜购自日本Nikon公司;NTS-1300水浴摇床购自日本Eyela公司;IS600细菌培养箱购自日本Yamato公司｡

1.2方法

1.2.1细菌回复突变试验试验流程､琼脂及溶液制备方法参见文献[5]｡细菌冻融液与营养肉汤混合后置于水浴摇床在37℃､120r/min条件下培养扩增10h,扩增后使用酶标仪对光密度进行检测,估算活菌浓度达到1×109个/mL后用于试验｡根据组氨酸溶解度,以灭菌注射用水作为溶媒,mini-Ames试验配制0.03､0.05､0.1､0.2､0.3､0.5､1mg/mL7个浓度,分别在有或无S9代谢活化条件下使用6孔板开展试验;标准平皿Ames试验配制0.01､0.02､0.03､0.05､0.1､0.2､0.3､0.4､0.5mg/mL9个浓度,分别在有或无S9代谢活化条件下使用标准平皿开展试验｡每毫升10%S9mix中含有0.335mL灭菌注射用水､0.5mL0.2mol/L磷酸氢钠缓冲液(pH7.4)､0.04mL0.1mol/LNADP溶液､0.005mL1mol/LG-6-P溶液､0.02mL1.65mol/LKCl-0.4mol/LMgCl2溶液､0.1mLS9溶液｡进行试验时,将0.1mol/L磷酸氢钠缓冲液(pH7.4)或S9mix､组氨酸､菌种和顶层琼脂混合均匀后铺板,mini-Ames试验加样量均为标准平皿Ames试验的1/5[6]｡试验设置灭菌注射用水溶媒对照组,每组平行3孔/皿,所有样本置于37℃恒温培养约48h后进行菌落计数｡

1.2.2菌落计数及结果判定计数每孔(皿)中的回复菌落数量,每个浓度组分别求得均值,并以sx±表示｡TA1535和TA1537试验组平均每皿(孔)中的回复菌落数大于溶媒对照组数值3倍,其他菌株试验组平均每孔(皿)中的回复菌落数大于或等于溶媒对照组数值2倍,且存在量效关系时判断结果为阳性;反之为阴性｡

2、结果

2.1mini-Ames试验

基于6孔板(孔底面积9.6cm2)的mini-Ames试验分别在非代谢活化和代谢活化条件下使用菌株TA98､TA100､TA1535和TA1537开展,菌落计数结果详见图1和图2｡非代谢活化条件和代谢活化条件下,组氨酸均诱导TA98､TA100和TA1535的回复突变菌落数呈剂量效应相关性的增加｡剂量较高时,TA98和TA100(非代谢活化条件TA98为4μg/孔,TA100为6μg/孔;代谢活化条件TA98为6μg/孔,TA100为4μg/孔)的回复突变菌落数与溶媒对照组比较增加倍数达2倍以上;在非代谢活化条件和代谢活化条件下,组氨酸剂量为4μg/孔及以上时,TA1535的回复突变菌落数与溶媒对照组比较增加倍数达3倍以上｡TA1537在两种条件下的回复突变菌落数与溶媒对照组相比均有所增加,但无明显剂量相关性｡且两种条件下,组氨酸剂量为20μg/孔时,所有菌株的回复突变菌落数均下降,甚至完全消失,但背景菌苔与溶媒对照组相比相对增厚,提示此时背景菌苔生长良好,组氨酸不具有细菌毒性｡

图1非代谢活化条件下mini-Ames试验结果(#TA98和TA100:AF-20.01μg/孔;TA1535:NaN30.1μg/孔;TA1537:9-AA12μg/孔)

图2代谢活化条件下mini-Ames试验结果(#TA98､TA100和TA1537:B(a)P5μg/孔;TA1535:2-AA0.6μg/孔)

2.2标准平皿Ames试验

在非代谢活化和代谢活化条件下分别使用TA97a､TA98､TA100､TA1535和TA1537开展基于标准平皿(皿底面积78.5cm2)的Ames试验,菌落计数结果详见图3和图4｡在非代谢活化条件下,组氨酸可诱导TA100和TA1535的回复突变菌落数呈剂量效应相关性的增加,且剂量达40μg/皿时TA1535与溶媒对照组比较增加倍数达2倍以上,但未达3倍｡TA98和TA1537的回复突变菌落数与溶媒对照组相比有轻微增加,但无明显剂量相关性｡TA97a的回复突变菌落数与溶剂对照组相比未见明显增加｡在代谢活化条件下,组氨酸可诱导TA98和TA100的回复突变菌落数呈剂量效应相关性的增加,但与溶媒对照组比较增加倍数都未达2倍及以上｡TA97a､TA1535和TA1537与溶媒对照组的回复突变菌落数相比有轻微增加,但无明显剂量相关性｡此外,当组氨酸剂量为50μg/皿时,可导致菌株(非代谢活化条件为TA97a､TA98和TA1535,代谢活化条件为TA97a和TA1537)的回复突变菌落数出现不同程度的下降,但菌株的背景菌苔与溶媒对照组相比相对增厚,提示此时背景菌苔生长良好,组氨酸不具有细菌毒性｡

3、讨论

本研究发现在mini-Ames试验中,当组氨酸剂量范围为4~6μg/孔(即组氨酸浓度在0.2~0.3mg/mL)时,TA98､TA100和TA1535的细菌回复突变菌落数明显增加,上述菌株试验结果呈阳性｡标准平皿Ames试验中细化了组氨酸浓度组并增加了菌株TA97a,但在非代谢活化条件和代谢活化条件下所有菌株均未见阳性结果｡目前,国内外有个别关于受试物中组氨酸含量对Ames试验结果的准确性影响的报道｡如,Aeschbacher等[4]发现试验体系中的组氨酸可能导致TA1535和TA100产生“假阳性”结果,建议含有组氨酸的受试物应尽量去除组氨酸后开展Ames试验｡何立伟等[7]发现在标准平皿Ames试验中,在非代谢活化条件下当组氨酸浓度高于0.2mg/mL时可能导致TA98和TA1535产生“假阳性”结果｡以上文献报道结果与本研究mini-Ames试验结果基本相符｡本研究mini-Ames试验中,TA98､TA100和TA1535三个菌株均因组氨酸的添加而出现背景菌落数大幅增加,这可能与mini-Ames试验体系所用试剂量和菌量为标准平皿Ames试验的1/5有关,前者更易产生阳性结果｡参考更为灵敏的mini-Ames试验结果,本研究提示受试物中的组氨酸浓度不应超过0.2mg/mL,否则可诱导TA98､TA100､TA1535菌株的自发突变率明显升高,出现“假阳性”结果｡

本研究采用的鼠伤寒沙门氏菌株中,TA97a和TA1537对组氨酸不敏感｡TA97a在编码组氨酸合成基因时的突变位点为01242位点,对高浓度葡萄糖尤为敏感[8],而本研究所用的基础琼脂培养基中约含2%葡萄糖,可能导致TA97a生长缓慢,后续可以将葡萄糖浓度降低至0.4%,使TA97a的菌落充分生长｡而TA1537则可能与其不含有pKM101质粒有关,该质粒可增强菌株对致突变物敏感性[9]｡此外,本研究中发现组氨酸浓度较高时会影响菌株菌落数和背景菌苔｡如,mini-Ames试验中组氨酸给药剂量为10μg/孔(即浓度为0.5mg/mL)及以上时,所有菌株菌落数减少甚至无法观察;标准平皿Ames试验中组氨酸给药剂量为50μg/皿(即浓度为0.5mg/mL)时,TA97a､TA98和TA1535在非代谢活化条件下,TA97a和TA1537在代谢活化条件下回复菌落数均较少,但两种不同试验中均观察到背景菌苔增厚｡前期研究提示,在固态培养体系中样品的组氨酸含量大于或等于15.52μg(对应浓度为0.3mg/mL)时会产生“假阳性”结果;而在液体培养体系中组氨酸浓度大于50mg/L(即0.05mg/mL)时,组氨酸不再是菌落生长的限制性因素[10]｡通常背景菌苔生长不良可以判断受试物具有细菌毒性,但本研究使用固态培养体系,综合mini-Ames试验和标准平皿试验结果,当组氨酸浓度为0.5mg/mL及以上时,菌株菌落数减少但菌苔背景增厚的原因与细菌毒性无关,而可能与充足的组氨酸促使菌株不断生长､增殖并融合成片有关,从而导致菌落无法计数｡因此,若受试物所含的组氨酸浓度达到0.5mg/mL及以上时,即便不导致回复突变菌落增加,也可能对其菌落计数产生影响｡

图3非代谢活化条件下标准平皿Ames试验结果(#TA97a和TA98:AF-20.1μg/皿;TA100:AF-20.01μg/皿;TA1535:NaN30.5μg/皿;TA1537:9-AA40μg/皿)

图4代谢活化条件下标准平皿Ames试验结果(#TA97a和TA1535:2-AA1μg/皿;TA98､TA100和TA1537:B(a)P5μg/皿)

综上所述,组氨酸含量可对Ames试验中菌株菌落数及背景值产生影响,建议在含有组氨酸的受试物(如某些中药制剂)时,应测定其中组氨酸含量｡如组氨酸含量较高(浓度高于0.2mg/mL)时应尽量去除组氨酸,避免其干扰,使试验结果更有说服力｡当受试物中组氨酸难以去除时,有文献建议可在阴性对照组加入与受试物中等量的组氨酸,作为试验体系的参照｡金建玲等[11]在检测猫眼草水煎液的致突变性时通过增设含相同浓度组氨酸的阴性对照,排除样品中组氨酸成分对试验结果的影响｡Busch和Bryan[12]则引入了一种不发生回复突变的组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌NS1135作为对照,该菌可在很宽的浓度范围内随组氨酸浓度的增加而线性增加｡此外,还可将组氨酸有限的传统固态培养改良为富含组氨酸的液体悬浮培养,从而保证结果的准确性｡

参考文献:

[2]于仲波,吴南翔,金锋,等.1485种化学物致突变试验和致癌试验结果一致性比较[j].毒理学杂志,2007,(4):320.

[3]刘波,金建玲,张辉,等.aMES测试不确定性分析[j].应用与环境生物学报,2007,13(5):726-730.

[5]胡燕平,宋捷,李波.细菌回复突变试验背景数据的采集[j].中国新药杂志,2009,18(22):2110-2112.

[7]何立伟,李子南,李芳,等.受试物中组氨酸含量对aMES试验自发回变菌落数的影响[j].毒理学杂志,2017,31(5):388-390.

[11]金建玲,张辉,刘波,等.猫眼草水煎液体外致突变性的研究[j].中国药理学通报,2010,26(2):263-266.

基金资助:药品监管科学全国重点实验室课题(2023skldrs0128);

文章来源:吴辉,汪祺,宋捷,等.组氨酸含量对细菌回复突变试验背景值的影响[j].中国医药生物技术,2025,20(01):107-111.