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夏枯草不同生长期3种酚酸成分含量动态探究

2021-01-21 301 上传者：管理员

摘要：目的通过研究野生与栽培夏枯草全草不同生长期的指纹图谱及3种酚酸成分含量动态变化规律,确定夏枯草全草的最佳采收期,研究全草的药用价值,并对野生与栽培夏枯草进行差异性比较。方法采用UPLC法测定野生与栽培夏枯草全草的指纹图谱及迷迭香酸、异迷迭香酸苷和咖啡酸的含量。结果夏枯草全草不同生长时期3种酚酸成分的含量差异较大;野生夏枯草与栽培夏枯草指纹图谱存在一定差异,3种酚酸成分含量差异不明显。结论夏枯草全草的最佳采收期在6月中上旬,野生与栽培夏枯草全草均具有一定的入药价值。

关键词：
夏枯草
栽培
生长期
迷迭香酸
野生
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夏枯草PrunellavulgarisL.为唇形科夏枯草属多年生草本植物,以干燥果穗入药,为我国常用中药材,自1963年版《中国药典》起,中国历届药典都收载了夏枯草[1]。夏枯草常用于治疗目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈、乳癖、乳房胀痛等,现代研究表明夏枯草中主要的活性成分为三萜及其苷、酚酸、黄酮及多糖类,其中的酚酸类具有抗病毒、抗氧化及抗肿瘤等生物活性[2]。

夏枯草作为药食两用中药,近几年被广泛用于“王老吉”“加多宝”等多种凉茶的制作生产,以夏枯草为原料的中成药及保健产品也如雨后春笋般层出不穷。以往夏枯草主要以野生品种供应市场,而近年来国内外对夏枯草的需求量越来越大,夏枯草人工规范化栽培已成为趋势[3,4]。目前《中国药典》收载的入药部位为果穗,而经考证,夏枯草药用部位经历了带穗全草、果穗及带穗全草、单用半枯或成熟果穗3个时期[5]。也有研究表明,夏枯草果穗的最佳采收期在6月下旬,茎叶的最佳采收期为5月底,叶中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量,认为夏枯草全草具一定的入药价值[6]。本试验通过测定野生与栽培夏枯草全草不同生长发育期的指纹图谱及3种酚酸成分的含量,为确定夏枯草全草的最佳采收期及全草的药用价值提供参考依据。

1、材料

1.1样品及其来源

供试野生与栽培夏枯草全草共20份,由湖南中医药大学王智副教授鉴定为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的全草,试验设在湖南中医药大学药植园夏枯草种植基地,地理坐标为E112°54',N28°08',海拔88m。试验地土壤为砂质黄壤土,肥力中等。2017年3月在3块试验地上播种,夏枯草种子由湖南中医药大学王智副教授提供,播种前施入有机复合肥作为底肥一次性施入土壤。于2018年3月—6月在夏枯草种植基地设置采样区,每次随机采集栽培夏枯草植株5～20株(含根),同时采集原本生长在药植园其他区域的野生夏枯草植株(含根),并在夏枯草生长期间观察植株生育期进程并记录。栽培夏枯草3—4月份每间隔约15d采集一次,进入成熟期后间隔约7d或3d采集一次,因野生夏枯草数量有限,从5月份开始采集,栽培样品共采集11次,野生样品共采集9次。全草样品于阳光下晒干,粉碎混匀后过筛(40目),编号装袋保存。材料信息如表1所示。

1.2仪器与试药

WatersAcquityUPLC超高效液相色谱仪(沃特世公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);万分之一CP114型电子分析天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司];101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗器械厂);电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂);0.22μm微孔滤膜(上海安谱试验科技股份有限公司)。

表1野生与栽培夏枯草全草供试样品

迷迭香酸(批号:140318,纯度>98%)、咖啡酸(批号:140107,纯度>98%)(四川维克奇公司),异迷迭香酸苷(课题组自制,经HPLC检测,纯度>98%),乙醇、甲醇均为分析纯,乙腈和甲醇为色谱纯,试验用水均为超纯水(18.25MΩ·cm)。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为ACQUITYUPLC@BEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm),柱温30℃,流速0.3mL·min-1,进样量1μL,波长280nm,流动相为A为甲醇,B为0.1%甲酸水,梯度洗脱,具体洗脱程序如表2,色谱图见图1。

表2UPLC梯度洗脱

2.2供试品溶液的制备

精密称取夏枯草药材粗粉约0.1g,加入20mL70%甲醇提取溶剂,水浴回流提取30min,冷却称重,70%甲醇补足重量,0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。

2.3对照品储备液的制备

分别精密称取对照品异迷迭香酸苷0.0021g,迷迭香酸0.0022g和咖啡酸0.0024g,置于10mL量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,配制成含异迷迭香酸苷0.21mg·mL-1、迷迭香酸0.22mg·mL-1和咖啡酸0.24mg·mL-1的混合对照品储备液。

图1混合对照品(A)和夏枯草样品(B,Z8)的UPLC图

2.4野生与栽培夏枯草药材3种酚酸成分测定

2.4.1线性关系考察

分别精密吸取“2.3”项下对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL置于5mL量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,得到不同浓度对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得到标准曲线方程及线性范围,见表3。

表33种成分线性方程

2.4.2精密度试验

取同一份夏枯草供试品溶液(Z8)连续进样6次,结果咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3种成分的峰面积RSD分别为0.32%、1.1%和1.3%,表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验

取同一份夏枯草供试品溶液(Z8),分别于样品制备后的0、2、4、6、8、10、12、24h进样,测定峰面积,计算RSD。结果溶液中咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3种成分峰面积RSD分别为1.7%、2.1%和1.5%。表明24h内供试品溶液稳定性良好。

2.4.4重复性试验

称取Z8药材约0.1g共6份,精密称定,按照“2.2”项下方法制备供试品溶液,测定咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸的峰面积RSD分别为2.0%、2.7%和2.2%,表明该方法的重复性良好。

2.4.5加样回收试验

取已知含量的夏枯草药材(Z11)粉末约0.1g,精密称定,平行6份,分别加入0.5mL的同一对照品溶液,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,测定含量并计算各成分的加样回收率。结果表明咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3种成分的加样回收率均值分别为99.6%、100.2%、99.4%,RSD分别为1.6%、1.2%、1.3%,表明该方法的准确度良好。

2.4.6样品测定

精密称取20份夏枯草样品,分别将11批栽培品和9批野生品按“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定,结果见表4。

表4野生与栽培夏枯草全草不同生长期中3种成分的含量

2.5野生与栽培夏枯草UPLC图谱的建立

选取栽培样品Z1为参照图谱,导入20批样品UPLC数据及图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)软件进行处理,建立具有18个峰的野生与栽培不同生长期的UPLC共有模式(见图2),通过与对照品进行对照,确定4号峰为咖啡酸,9号峰为异迷迭香酸苷,10号峰为迷迭香酸。

图2野生与栽培夏枯草全草不同生长期对照图谱

2.6数据分析

2.6.1野生与栽培夏枯草不同生长期3种酚酸成分变化趋势图

将表4的数据分别以各指标性成分的含量为纵坐标,以不同采收月份为横坐标,绘制野生与栽培夏枯草3种酚酸成分随采收月份变化的趋势图(见图3)。如图所示,栽培和野生夏枯草中3种酚酸成分含量随月份变化的趋势大致相同,其中异迷迭香酸苷、迷迭香酸含量从3月到6月逐月累积,到6月10日最高,之后逐渐下降。

图3栽培(A)和野生(B)夏枯草全草不同生长期3种成分含量变化趋势图

2.6.2两样本独立t检验

采用SPSS21.0软件对同一时期的野生与栽培夏枯草样本的数据进行独立样本t检验,通过分析得到3种成分均具有方差齐性(P>0.05)的特点。但对同一生长时期的野生与栽培夏枯草而言,3种成分的含量在野生品与栽培品之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6.3聚类分析

以20批夏枯草样品中18个共有峰的峰面积为变量,采用SPSS21.0软件对样本进行聚类分析(见图4)。以欧式距离为测度,采用Ward法对数据进行标准化处理,结果样品被聚成单独两类,a类为不同生长期的野生夏枯草样品,b类为不同生长期的栽培夏枯草样品。

图4不同生长期野生与栽培夏枯草系统聚类图

2.6.4偏最小二乘判别分析

为进一步评价野生与栽培夏枯草不同生长期的成分含量差异,筛选导致样品间差异的化学成分,以18个共有峰的峰面积为变量,采用SIMCA-P13软件进行偏最小二乘法-判别分析(partialleastsquaresdiscriminantanalysis,PLS-DA)和变量投影重要性图(variableimportanceplot,VIP)分析,建立PLS-DA的3D图和VIP图(见图5)。按PLS-DA的结果对18个共有峰峰面积的VIP值大小进行排列,结果显示5、4、10、16和7号色谱峰的VIP值均大于1,表明以上化学成分对不同生长期的野生与栽培夏枯草样品差异性影响较大,其余色谱峰VIP值小于1,对样品的区分较小。其中4号峰为咖啡酸,10号峰为迷迭香酸。

3、讨论

3.1夏枯草全草的最佳采收时期

本文研究结果表明,6月10日野生和栽培夏枯草全草中的迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量达到最高水平,咖啡酸含量也处于较高水平,确定6月10日左右为野生与栽培夏枯草全草的最佳采收期。而之前有研究表明夏枯草果穗的采收期在6月下旬为宜,茎叶的采收期为5月底,认为全草的最佳采收期可将果穗和茎叶的最佳采收期进行适宜的折中,本研究佐证了这一推测[6]。6月10日以后3种成分的含量均呈现下降趋势,且6月10日以后整个植株开始枯萎,考虑所处地区气候,如果下雨植株易倒伏。若过早采收,代谢产物积累不足,活性成分含量不高,如异迷迭香酸苷在3—4月间的积累量不足未达到检测限;若过迟采收,则受到自身代谢和江淮地区梅雨期的影响,使活性成分减少,因此,本文研究认为江淮地区夏枯草全草的最佳采收期为6月中上旬,在果穗半/全枯、植株未枯萎之际。

图5夏枯草样品偏最小二乘判别分析3D图与VIP图

3.2野生与栽培夏枯草全草的入药价值

2020年版《中国药典》规定夏枯草果穗迷迭香酸含量不少于0.2%,野生与栽培夏枯草全草的最佳采收期6月10日时的迷迭香酸含量均已达到药典入药标准,野生与栽培夏枯草全草均具一定的入药价值。关于夏枯草的药用部位,古代文献记载与现代临床应用颇不一致,古人用夏枯草有用茎、叶者,也有用花者,而现在全国大多数地区销售和临床所用则以果穗为主导,目前已有研究表明夏枯草茎叶中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量,夏枯草全草的抗肿瘤作用不逊于夏枯草果穗[6,7]。而我国西南地区及东南亚地区仍有使用夏枯草全草的习惯,在欧洲和台湾也多见夏枯草全草使用[2,8]。夏枯草全草入药能提高夏枯草利用率,特别是在自然资源不足时,对于保护夏枯草野生资源、维护生态环境具一定的现实意义。

4、结论

本文确定了夏枯草全草的最佳采收期为6月中上旬,野生与栽培夏枯草全草3种酚酸成分不同生长期的含量差异不明显,到采收期后两者均具有入药价值。目前国内外对夏枯草的研究较多,主要为单一成分研究,不够深入,其药理作用的研究也主要停留在粗提物,而且关于夏枯草中的单体化合物或某个部位的代谢的研究几乎没有[9,10]。本研究表明,夏枯草3种酚酸成分随不同采收月份的变化趋势具有一致性,特别是迷迭香酸和异迷迭香酸苷,这提示在植物体内这3种成分的代谢过程可能具有相关性,需要进一步深入研究。本研究系统地比较了野生与栽培夏枯草不同生长时期化学成分的差异,明确了其变化趋势,为确定夏枯草全草的适宜采收期提供了科学依据,同时也为夏枯草药材质量的综合评价和控制提供可靠的方法。

参考文献：

[1]中国药典2020年版.一部[S].2020:292.

[3]陈宇航.夏枯草规范化种植技术及其药材质量控制[D].南京:南京农业大学,2011.

[4]董元火,刘虹,夏恒建,等.基于迷迭香酸含量的湖北夏枯草野生种质资源的评价[J].江汉大学学报(自然科学版),2016,44(5):444-447.

[5]陈宇航,郭巧生,王澄亚.夏枯草本草及其入药部位变化的考证[J].中国中药杂志,2010,35(2):242-246.

[6]王玉霞,尹金宝,郭巧生,等.夏枯草不同部位活性成分含量动态研究[J].中国中药杂志,2011,36(6):741-745.

[7]陈雨凤.夏枯草全草与果穗抗肿瘤作用比较研究[D].济南:山东中医药大学,2007.

[8]戚进,胡正芳,刘志军,等.夏枯草的化学成分[J].中国天然药物,2009,7(6):421-424.

[9]卢旻昱,刘铜华,侯毅,等.夏枯草的药理作用及研究进展述要[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(31):31-33.

[10]张金华,邱俊娜,王路,等.夏枯草化学成分及药理作用研究进展[J].中草药,2018,49(14):3432-3440.

皮胜玲,郭小兰,刘密,李伟,刘湘.野生与栽培夏枯草不同生长期3种酚酸成分含量动态研究[J].中南药学,2021,19(01):100-104.