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辐照灭菌对桃红丸主要成分的影响

2021-02-24 336 上传者：管理员

摘要：目的通过建立桃红丸的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的分析方法，分析60Co-γ射线辐照前后其有效成分的含量变化。方法采用HPLC法对桃红丸进行色谱分析，以C18(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱，乙腈-磷酸溶液(pH2.6)为流动相，进行梯度洗脱，于230nm波长处检测。将未辐照样品的色谱图作为对照图谱，应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行相似度评价。结果辐照前后供试品的色谱峰数量、峰形情况无明显区别，指标成分含量无明显变化。结论通过高效液相色谱法结合多指标定量测定法测定桃红丸较为可靠，该方法比较全面地反映了桃红丸的含量变化，可为其质量控制提供较为可靠的科学依据。

关键词：
含量测定
指纹图谱
桃红丸
辐照灭菌
高效液相色谱
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桃红丸为我院开发的非标准制剂(制剂许可证号:总制字2016F202004)，具有活血化瘀、调经止痛的功效，在治疗关节炎、月经不调、冠心病、皮肤色斑方面疗效显著[1,2,3,4]。桃红丸由桃仁、红花、当归、川芎、赤芍等9味药组成，其中桃仁、红花为君药，是活血化瘀方剂中的经典组合。桃仁中主要含有各种脂肪酸、不饱和脂肪酸、甾醇及糖苷类，黄酮类化合物等[5];红花主要含色素、黄酮类化合物，生物碱类，其中羟基红花黄色为最主要的有效成分[6,7,8,9];当归、川芎、赤芍为臣药，主要的有效化学成分有芍药苷和阿魏酸、川芎内酯等[10]。由于处方中含有原药材粉末，现有的灭菌工艺有时不能达到微生物限度检查要求，需要60Co-γ辐照灭菌处理。

20世纪70年代以来，60Co-γ辐照灭菌在全世界广泛展开，由于其穿透力强、使用方便、省时省力、价廉、节能等特点，且在常温下就可达到理想的灭菌效果[11,12,13]。近年来辐照灭菌技术被广泛应用于医药食品行业、农业、工业生产等，中药制剂领域也开始普遍使用60Co-γ射线辐照灭菌[14,15,16,17,18,19]，尤其是对易挥发、热敏感的中药材及蜜丸的灭菌，更能体现出其优越性[20]。本研究通过建立辐照前后桃红丸的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，同时选取测定该制剂中的3种有效成分羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸在辐照前后的含量变化，考察辐射灭菌对桃红丸的影响，为辐照灭菌技术在中药制剂中应用提供科学依据。现报告如下。

1、仪器与试药

1.1试验仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪(G1322型在线脱气机、G1311A型二元泵、G1313A型自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、A.08化学工作站，美国Agilent公司)，BT214D型、BT125D型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试验药品

乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司);85%磷酸;甲醇为分析纯;水为超纯水。阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110773-201313;纯度以99.6%计);芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110736-200630，纯度以95.7%计);羟基红花黄色素A对照品(中国食品药品检定研究院，批号:111637-301308)。桃红丸(批号:20180320)，桃红丸(批号:20180320，辐照剂量8kGy)。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为ShimadzuVP-ODSC18(4.6mm×250mm,5μm)，柱温为室温，流速1ml/min;检测波长230nm。以乙腈为流动相A，磷酸溶液(pH2.6)为流动相B，梯度洗脱(0～20min,95%～78%B;20～35min,78%～70%B;35～45min,70%～60%B;45～50min,60%～25%B;50～51min,25%～95%B);平衡时间为10min;进样量为20μl。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备液的制备:

精密称定羟基红花黄色素A、阿魏酸对照品各约10mg，分别置100ml量瓶中，精密称定芍药苷对照品约25mg，置25ml量瓶中，分别加入适量50%甲醇，超声处理2min使其溶解，放至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，获得每1ml含羟基红花黄色素0.1mg、阿魏酸0.1mg和芍药苷1mg的单一成分对照品储备液。

2.2.2混合对照品溶液的制备:

精密量取羟基红花黄色素A对照品储备液1ml、阿魏酸对照品储备液0.5ml和芍药苷对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液的制备:

取桃红丸细粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇液30ml，称定重量，超声处理8min，放至室温，加50%甲醇液补足减失的重量，摇匀，放置，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验:

取空白溶剂(50%甲醇)和对照品溶液分别进样，记录色谱图，见图1。由图可知，空白溶剂不干扰测定。

图1空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的指纹图谱

2.3.2线性与范围:

取各对照品储备液逐级稀释成系列浓度的对照品溶液进行分析，记录3种对照品的色谱峰面积，以各指标成分的浓度(X，μg/ml)为横坐标，以色谱峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。见表1。结果表明3个指标成分在所测定的浓度范围内线性关系较好。

表1桃红丸三种成分的线性与范围

2.3.3精密度试验:

取混合对照品溶液，连续进样6次，记录3个组分的峰面积。羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸峰面积的RSD值分别为1.5%、0.6%、1.9%。结果表明仪器的精密度良好。

2.3.4重复性试验:

平行制备6份供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。记录供试品中各指标成分相应的峰面积，计算其含量，并将6次测定结果的RSD用于考察方法的重复性。供试品溶液中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸3个指标成分含量的RSD值分别为2.0%、2.6%和2.7%。结果表明该方法的重复性较好。

2.3.5回收率试验:

精密称定桃红丸细粉约0.5g，共6份，分别置具塞锥形瓶中，每个锥形瓶中分别加入羟基红花黄色素A对照品储备液2.5ml、芍药苷对照品储备液1.5ml和阿魏酸对照品储备液2.5ml，再精密加入50%甲醇至30ml，称定重量，按“2.2.3供试品溶液的制备”项下方法配制辐照后的供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。根据回收率=(测得量-样本含量)/加入量×100%计算3个指标成分的回收率。见表2。

表2加样回收率的实验结果

2.3.6稳定性试验:

取辐照后桃红丸的供试品溶液，分别于0、3、6、9、24h进样，记录色谱图。计算三个指标成分相应峰面积的RSD值以考察该溶液的稳定性。羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸的峰面积的RSD值分别为1.5%、1.7%和2.1%。结果表明供试品溶液在24h内的稳定性良好。

2.4供试品含量测定

取辐照前与辐照后的供试品溶液和混合对照品溶液进行分析，并记录色谱图。采用外标一点法计算供试品中3个组分的含量。测得供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸辐照前的含量分别为0.5582mg/g、3.1050mg/g、0.4589mg/g;供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸辐照后的含量分别为0.5526mg/g、3.1180mg/g、0.4625mg/g，辐照后含量无明显变化。

2.5相似度分析

2.5.1供试品对照指纹图谱的建立:

取辐照前桃红丸细粉，制备供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。

2.5.2指纹图谱分析:

取辐照后桃红丸细粉制备8份供试品溶液，分别进样，测定供试品的指纹图谱。

2.5.3相似度分析:

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》研究版(2004A)对辐照前后的指纹图谱进行分析，以辐照前样品的色谱图为参照图谱，采用多点校正，用中位数法生成对照指纹图谱和指纹图谱。见图2。处理数据，计算相似度，相似度均≥0.999。相似度计算结果可以看出辐照前后桃红丸的含量变化并无显著差异。

图2桃红丸对照指纹图谱和供试品指纹图谱

3、讨论

本研究结果显示，所建立的指纹图谱方法验证结果良好，能够满足桃红丸辐照前后主要成分含量变化。辐照前后，桃红丸中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸的含量均没有显著变化;辐照前后指纹图谱的相似度很高，没有峰个数的增加或缺失。实验过程对检测波长进行了考察，采用DAD全波长扫描检测器，在190～400nm波长范围内扫描，分别在230、254、320、403nm处对整个图谱进行比较，发现230nm处下各成分具有较好的紫外吸收，出峰数目相对较多，各色谱峰峰形及分离效果相对较好，且基线较为平稳，故选择230nm为测定波长。

该实验分别对体积分数为50%甲醇、甲醇、50%乙醇及乙醇为提取溶剂进行了考察，经过对比峰形、响应值、峰分离情况，甲醇的提取效果更好一点。随后又对体积分数为75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水作了进一步考察，经过比较，最后选择体积分数为50%甲醇为提取溶剂。

该实验过程还对流动相进行了优选，首先选择甲醇-水进行考察，提取溶剂为体积分数为50%甲醇，进行指纹图谱的分析，但峰分离不好，基线上漂。随后又考察了甲醇-磷酸溶液(pH2.6)、甲醇-磷酸溶液(pH4)、甲醇-0.5%乙酸、甲醇-1%乙酸、甲醇-KH2PO4溶液(磷酸调至pH4)、甲醇-KH2PO4溶液(30mmol/L,pH3)、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液(pH2.6)等流动相体系，以色谱峰基线的平稳情况、指标成分的峰形以及分离效果为目标，最佳的流动相为乙腈-磷酸溶液(pH2.6)。

综上所述，通过高效液相色谱法结合多指标定量测定法测定桃红丸较为可靠，该方法比较全面地反映了桃红丸的含量变化，可为其质量控制提供较为可靠的科学依据。

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