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耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药性及临床特征的相关性分析

2020-08-21 255 上传者：管理员

摘要：目的：对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）耐药性及临床特征进行相关性分析。方法：回顾性分析2018年1月-2019年3月中国科学技术大学附属第一医院临床分离的CRKP标本及科室分布，并对CRKP耐药性进行分析，收集CRKP阳性患者临床资料，对CRKP阳性患者预后好转组和预后不良组危险因素进行相关性分析。结果：72株CRKP主要来自痰液（37株，51.4%）、血液（10株，13.9%）、引流液（6株，8.3%）和中段尿（5株，6.9%）等标本，菌株分布科室排名前三位科室分别是综合ICU(24株，33.3%）、神经重症科室（14株，19.4%）和神经外科（13株，18.1%）。CRKP对替加环素的耐药率仅4.0%，对复方新诺明和阿米卡星的耐药率为72.2%和83.3%，对其他的抗生素耐药率均大于90%。CRKP阳性患者预后好转组和预后不良组危险因素比较，Logistic多因素回归分析，脏器损伤（OR=16.645,95%CI:3.599～76.984,P=0.000）和拉丝试验阳性（OR=16.174,95%CI:1.477～180.735,P=0.024）是预后不良的独立危险因素。结论： CRKP在综合ICU、神经重症科室和神经外科居多，主要来自痰液和血液标本。替加环素对CRKP有很好药物活性，脏器损伤和高毒力肺炎克雷伯菌是CRKP感染预后不良的独立危险因素。

关键词：
临床特征
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌
耐药性
高毒力肺炎克雷伯菌
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肺炎克雷伯菌是院内感染的重要致病菌之一，随着碳青霉烯类抗生素在临床广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌检出率呈上升趋势[1]。2017年中国细菌耐药性监测显示，Kpn对碳青霉烯类药物的耐药率已超过20%[2]。自1986年台湾首次报道Kpn性肝脓肿，转移并引发多部位感染，高毒力肺炎克雷伯菌致病性越来越受到广泛高度关注[3]。hvKP在美洲、欧洲、澳大利亚、南非等地区相继报道，但是，感染人群主要为亚裔人群，可能与易感基因和hvKP地区流行分布有关[3,4]。和普通Kpn相比，这种hvKP在琼脂培养基上表现高黏液特性，可导致健康宿主非传统部位严重感染，增加死亡风险。若hvKP获取耐药基因，成为耐碳青霉类hvKP，将成又一种“超级细菌”，给临床治疗带来新的挑战[5]。本文回顾性分析2018年1月-2019年3月临床分离CRKP耐药性及临床特征分析，为临床诊疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1一般资料

2018年1月-2019年3月中国科学技术大学附属第一医院52例住院患者临床标本分离CRKP72株（剔除同一部位重复菌株）。52例患者中男36例，女16例，中位年龄59.2岁，收集患者一般资料，30例患者入院时间>20 d,28例患者入住ICU,37例患者有基础疾病（心血管疾病、肝胆疾病、肺部疾病、肾脏疾病、神经系统疾病、糖尿病、消化系统疾病及肿瘤等），21例患者脏器损伤，43例患者手术（其中22例行气管切开术），39例患者联合抗生素，30例患者抗生素使用>7 d,29例患者人工气道，26例患者有留置导管（深静脉导管、导尿管、体腔引流管等），12例患者低蛋白血症，3例患者透析，最后29例患者好转，16例患者预后不良，7例患者死亡。

1.2研究方法

标本采集及培养严格按照《全国临床检验操作规程》操作，血培养采用BacT/Alert3D全自动血培养仪，菌种鉴定及药敏试验采用WalkAway40SI和VITEK2-compact全自动细菌分析仪及相应卡片进行鉴定及药敏试验。厄他培南、亚胺培南和美罗培南药敏结果进一步采用纸片法确认，结果判读参照美国临床实验室标准委员会（clinical and laboratory standard institute,CLSI)2017年判断标准进行[6]。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705（碳青霉烯酶阳性）和ATCC BAA-1706（碳青霉烯酶阴性）。CRKP阳性患者预后好转组和预后不良组（预后不佳和死亡归纳为预后不良）危险因素比较。

1.3碳青霉烯酶表型鉴定

1.3.1改良Hodge试验（modified Hodge test,MHT）

根据2017年CLSI操作标准进行操作[7],0.5麦氏浊度ATCC25922菌液稀释10倍，均匀涂布MH平板。亚胺培南、美罗培南或厄他培南纸片贴于平板中央。设阴阳性对照，用1μL接种环取菌落从药敏纸片边缘垂直划线，长度为20～25 mm。35℃培养16～18 h后观察结果。产碳青霉烯酶菌株在大肠埃希菌质控菌株抑菌圈交界处增强生长。

1.3.2改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapeneminactivationmethod,m CIM)

根据2017年CLSI操作标准进行操作[7]，取1μL接种待测菌落或者质控菌株到2 m L TBS营养肉汤，漩涡震荡10～15 s，再放入美罗培南药敏纸片，35℃培养4 h±15 min。配制0.5麦氏浓度大肠涂布MH平板上，干燥3～10 min，取出孵育后的美罗培南纸片，控水，将其贴在MH平板上。35℃培养18～24 h后观察结果。结果判读：(1)抑菌圈直径6～15 mm或16～18 mm，抑菌圈内有散在菌落为阳性；(2)抑菌圈直径≥19 mm，圈内无散在抑菌圈，为阴性；(3)抑菌圈直径为16～18 mm，或者抑菌圈直径≥19 mm，圈内有散在抑菌圈，为灰区。1.4

1.4拉丝试验

用接种环接种琼脂平板已过夜新鲜菌落向外牵拉，粘液丝能拉长≥5 mm，判断为高黏表型阳性，<5 mm则为阴性。

1.5统计学分析

应用WHONET 5.6软件，SPSS18.0软件进行统计分析，单因素分析采用c2检验，将单因素分析中差异有统计学意义的因素纳入Logistic回归模型进行多因素分析。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1CRKP临床科室分布

72株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌来自综合ICU(24株，33.3%）、神经重症科室（14株，19.4%）、神经外科（13株，18.1%）、康复科（5株，6.9%）、心脏外科（4株，5.6%）、内分泌科（3株，4.2%）、干部病房（2株，2.8%）、神经内科（2株，2.8%）、心外科ICU(2株，2.8%）、胸外科（1株，1.4%），血液内科（1株，1.4%）和急诊外科（1株，1.4%）。

2.2CRKP标本分布

72株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分离于痰液（37株，51.4%）、血液（10株，13.9%）、引流液（6株，8.3%）、中段尿（5株，6.9%）、脓性分泌物（4株，5.6%）、导管（3株，4.2%）、脑脊液（2株，2.8%）、腹水（1株，1.4%）、心脏灌洗液（1株，1.4%）和其他标本（3株，4.2%）。

2.3碳青霉烯酶表型试验

MHT阳性结果见图1（封二），65株为阳性，阳性率为90.3%,mCIM阳性结果见图2（封二），70株为阳性，阳性率为97.2%。其中2株耐药菌MHT和mCIM结果均阴性。两种试验比较，差异无统计学意义（x2=2.963,P=0.085）。

2.4拉丝试验

22株CRKP拉丝试验阳性，见图3（封二）。这22株CRKP来自10例患者不同部位标本，其中有6例CRKP血流感染，7例出现感染性休克，2例感染死亡，仅1例出院尚可。10例患者中5例糖尿病，1例心脏术后，纵隔脓肿入院；2例腹腔感染；1例脓气胸，伴胆囊炎；1例胸腔感染（在引流物中均培养出CRKP）。

2.5耐药性分析

CRKP对替加环素的敏感性最好，耐药率仅4.0%，对复方新诺明和阿米卡星的耐药率为72.2%和83.3%，对其他的抗生素耐药率均大于90%，见表1。

表1 CRKP对常用抗生素的耐药率

2.6 CRKP阳性患者预后好转组和预后不良组危险因素比较

CRKP阳性患者预后好转组29例，预后不良组23例（预后不佳16例和死亡7例）。单因素比较，年龄、脏器损伤、透析、拉丝试验阳性差异有统计学意义（P<0.05），见表2。进一步将此4个因素纳入Logistic回归模型进行多因素分析，合并脏器损伤（OR=16.645,95%CI:3.599～76.984,P=0.000）和拉丝试验阳性（OR=16.174,95%CI:1.477～180.735,P=0.024）是CRKP感染预后不良的独立危险因素。

表2 CRKP阳性患者预后好转组和预后不良组危险因素比较[n(%)]

3、讨论

产碳青霉烯酶是Kpn对碳青霉烯类药物耐药的主要机制，按Ambler分类，分为A、B和D类，A和D类为丝氨酸碳青霉烯酶，A类编码基因以kpc、tem、shv、ges和ctx多见；D类以oxa多见。B类为金属酶，编码基因为imp、ndm、vim和gim等。部分编码的基因可通过质粒水平传播，国内以kpc-2居多，kpc-2酶不需要依赖于膜孔蛋白的丢失，由可转移的70 kb质粒编码，在质粒转座子上，具有高传播性，易导致暴发流行[8]。准确、简单、快速的检测产碳青霉烯酶菌株，对临床治疗和预防院内感染极为重要。MHT是2009年CLSI推荐的碳青霉烯酶表型检测方法[9],mCIM是2017年CLSI新推荐的一种筛查方法，多篇文献报道，该方法有较好的特异性和敏感性[10,11]。本文中，72株CRKP,MHT检出率为90.3%,mCIM检出率为97.2%。有报道，MHT对B类，特别是ndm检出率比较低，存在漏检[12]。2018年CLSI推荐eCIM取代MHT，可联合mCIM进行金属酶检测。2株MHT和mCIM均阴性，可能该菌株对碳青霉耐药的机制是膜孔蛋白的丢失、靶位改变、生物被膜形成、主动外排和高产AmpC/ESBLs等，而不是产碳青霉烯酶。

本研究中，CRKP对很多抗生素耐药率>90.0%，为了满足临床用药需要，该院在2018年11月增加替加环素药敏试验，发现替加环素对CRKP有很高的敏感率。替加环素是第一个被批准用于临床的新型甘氨酰四环素抗生素，它具有很强的活性、抗菌谱广，对各种革兰阳性、阴性细菌和厌氧菌有很好的作用。因此，临床上将替加环素视为治疗CRKP最后防线，有文献报道，替加环素单用或者与其他抗生素联合治疗CRKP肺炎患者有显著疗效，联合运用抗生素疗效及细菌清除率更好[13]。然而，事物都有双面性，有研究报道，细菌主动外排系统和核糖体蛋白rpsJ基因缺失突变会导致对替加环素耐药[14,15]。需警惕替加环素的耐药性，不要过度依赖替加环素，诱导细菌耐药产生，最后出现无药可用的悲剧。

1986年台湾首次报道hvKP性肝脓肿，hvKP引起全球广泛关注，它易侵犯健康宿主并诱发脓毒血症，也可导致化脓性肝脓肿、眼内炎、骨髓炎、坏死性筋膜炎等严重的侵袭性疾病[16]。hvKP高毒力归因于两点：其一荚膜增厚所致高黏液性；其二产生大量有效的铁载体帮助细菌抵抗机体的杀菌作用并提高细菌存活率[3]。hvKP极易播散，引起其他重要转移性感染，预后较差，致死率高[17]。本研究中，hvKP导致多部位感染，特别是血流感染，多名患者出现感染性休克，并合并多功能脏器衰竭，预后极差，致死率高。其次，10例hvKP感染有5例是糖尿病患者，有文献报道糖尿病是hvKP感染的危险因素[18]，可能与糖尿病患者对糖利用减少，中性粒细胞调理和杀伤力减弱，高糖环境生长有助于细菌生长有关。

碳青霉烯类抗生素滥用往往会导致CRKP增多，乃至出现泛耐药菌，为临床治疗带来巨大困扰。目前在全球范围内多重耐药的hvKP也陆续报道，Siu等[19]曾报道1株K2型hvKP通过质粒结合kpc-2基因耐药；Wei等[20]也发现ST23型hvKP从ST11型菌株获得kpc-2基因。浙江大学附属第二医院曾报道5名术后患者，入住ICU感染ST11型产kpc-2的hvKP，因抗生素治疗无效，死于重症感染，将该菌命名为ST11 CR-hvKP，耐碳青霉烯类hvKP将成为下一种“超级细菌”[5]。本研究中，有一例脓气胸患者，入院初期胸腔引流液和痰液检出敏感hvKP，住院4 d后，胸腔引流液和痰液均检出耐碳青霉烯类hvKP，很有可能hvKP获取了携带kpc-2基因的质粒或可移动元件，从而对碳青霉烯类抗生素耐药。合理运用抗生素，减少耐药菌株产生，做好有效的院内感染控制工作，及时监控，同源性分析，切断传播途径，防止hvKP获得耐药，防止院内感染暴发流行，是当务之急。

参考文献：

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[11]何红,王紫嫣,李军,等.改良Hodge试验､CNPt及m CIM筛选肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶的价值[J].中国感染控制杂志,2019,18(5):375-379.

[13]陈爱凤,沈晓强,丁士标,等.替加环素治疗碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌肺炎的临床疗效及预后分析[J].浙江医学,2018,40(3):258-261,265.

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周馨,马筱玲,叶书来,戴媛媛.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药性及临床特征分析[J].热带医学杂志,2020,20(08):1017-1020+1043+992.