良性气道狭窄是多种原因引起的气道黏膜、软骨受损，气道瘢痕痉挛导致的气道狭窄性病变[1]。常见病因有机械通气时气管插管或切开导致的损伤，气管支气管黏膜结核、异物、外伤等，气道狭窄对患者身心健康及生活质量造成严重的影响[2]。气道瘢痕狭窄的机制多样，涉及多种原因及通路。气道黏膜和软骨组织的再生能力很低，损伤后难以一期愈合的方式修复，后期主要由瘢痕组织和瘢痕疙瘩填补创面[3]。Xue等[4]研究证明，气道瘢痕的形成与Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活密切相关，β-连环蛋白过表达可以上调人骨成型蛋白，导致气管软骨的破坏和瘢痕肉芽组织的增生。SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX9)属于SOX蛋白家族中的一个重要成员，已有研究报道发现，SOX9在心肌梗死后心肌瘢痕组织中呈现高表达，沉默SOX9基因后，心肌瘢痕成纤维细胞的增殖能力得到显著抑制[5]。本研究通过对气道狭窄新生肉芽组织样本中的RNA进行芯片分析发现SOX9也呈现高表达，且差异基因富集通路中包含有Wnt信号通路，Wnt/β-连环蛋白信号通路是Wnt经典的途径且与气道瘢痕密切相关。本研究探究SOX9基因是否通过Wnt/β-连环蛋白途径调控气道肉芽组织成纤维细胞的增殖和凋亡，以期为气道良性狭窄治疗新靶点提供一定的理论依据。

1、对象与方法

1.1对象

组织样本来源于2018年1月至2021年1月成都医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科就诊的50例良性气道瘢痕狭窄患者，男女各25例，年龄(55±11)岁。气道肉芽组织标本经硬质支气管镜钳取，其钳夹较普通纤维支气管镜活检钳大，保证钳取的组织足够进行原代细胞培养。标本取镜下最典型气道肉芽组织中央区域，少量正常气道黏膜组织取自非瘢痕狭窄区域，所有标本均经病理证实为气道肉芽组织，置于液氮中保存。本研究方案经成都医学院第一附属医院伦理委员会批准(2021CYFYIRB-BA-15-01)，患者及家属同意本研究并签署了知情同意书。

1.2纳入与排除标准

纳入标准:(1)因气管插管或气管切开或外伤导致中央气道狭窄;(2)经硬质支气管镜取气管新生狭窄处组织，病理检查均证实为气道肉芽组织。排除标准:(1)由于原发或继发性肺部肿瘤导致的气管狭窄;(2)合并有严重肝肾功能障碍、凝血功能或心肺功能不全;(3)合并有其他部位的肿瘤或恶病质。

1.3主要材料

(1)试剂:DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司);磷酸盐缓冲液、细胞裂解液、二甲基亚砜、0.25%胰蛋白酶、Trizol(上海懿贝瑞生物科技有限公司);反转录和逆转录聚合酶链反应试剂盒(日本TaKaRa公司);SOX9、无翅型MMTV整合位点家族成员3a(Wnt3a)、β-连环蛋白、淋巴细胞增强因子1(LEF1)、T细胞因子4(TCF4)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体及二抗(南京万类生物科技股份有限公司)，流式凋亡检测试剂盒(上海合生生物科技发展有限公司)及引物设计合成(广州莱博生物科技有限公司);细胞计数试剂盒8(CCK8)(上海碧云天生物科技有限公司);绿色荧光蛋白荧光标记的shRNA-SOX9慢病毒载体由上海生工生物工程有限公司构建和制备。(2)仪器设备:离心机、荧光显微镜、核酸定量检测仪(美国Thermo公司)、ABI8000实时定量PCR仪、培养箱、酶标仪(美国应用生物系统公司)。

1.4实验方法

1.4.1组织RNA提取

从液氮中取出部分组织标本，粉碎后添加Trizol1ml并使其充分混合，将氯仿200μl滴入混合液中离心，加入异丙醇500μl后，再次离心后留取沉淀物质注入焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，孵育10min,-80℃保存。

1.4.2基因芯片分析

分别选取5例气道瘢痕狭窄患者的气道肉芽组织和该患者气道正常黏膜组织mRNA片段送至广州辉俊生物科技有限公司进行芯片分析。芯片(AgilentSurePrintG3HumanGeneExpression表达谱芯片)由广州辉俊生物科技有限公司提供，利用GeneSpringV13.0软件分析差异基因(阈值:|log2FC|>2，调整后P<0.05)并绘制热图，并用R软件中的ClusterProfiler程序包分析差异基因所富集的信号通路。选择表达差异最明显的SOX9作为研究对象。

1.4.3气道肉芽组织成纤维细胞的分离和培养

将用于成纤维细胞分离的气道肉芽组织，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，剪碎加入0.25%Ⅰ型胶原酶溶解，在37℃下均匀振荡(120次/min)下消化3h;用等体积的DMEM(内含10%胎牛血清)培养液使上述混合液消化终止，进而用200目筛网过滤，过滤液充分收集到离心管后弃去上清液，使用培养液重悬细胞，依照4×104个/cm2的密度接种于100mm培养皿中，置于37℃和5%二氧化碳条件下继续培养。后续的实验所用细胞使用第2和第3代培养的细胞。

1.4.4shRNA-SOX9慢病毒转染

取对数生长期的气道肉芽组织成纤维细胞，使用感染液将细胞制作成5×105个/ml悬液种植到6孔细胞培养板中，按照慢病毒转染说明书加入适量的病毒液，培养12h，收集细胞入离心管，离心1min去掉上清液，更换为DMEM完全培养基培养72h，培养皿置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，后续实验所用细胞为感染效率高于90%的细胞，稳定感染shRNA-SOX9慢病毒的细胞标记为shRNA-SOX9(shRNA-SOX9组)，稳定感染shRNA阴性对照的慢病毒的细胞标记为阴性对照组，无质粒载体加入的细胞设定为空白对照组。

1.4.5气道肉芽组织成纤维细胞内SOX9及Wnt/β-连环蛋白通路相关基因表达

(1)按照商品使用说明书用Trizol试剂分别提取上述3组细胞总RNA，用ND-1200核酸定量检测仪(美国Thermo公司)测定总RNA是否合格，在吸光度值1.8～2.0时为质量合格。根据PrimeScriptTMRTMasterMix商品使用说明合成cDNA，使用SYBRRremixExTaqTM10μl体系进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)，反应在ABI8000实时定量PCR仪进行，以GAPDH为内参，SOX9、Wnt3a、β-连环蛋白、LEF1、TCF4引物为模版检测mRNA表达水平，引物序列见表1，上游引物均是0.4μl、cDNA1μl、RNaseFreeWater8.4μl。反应条件设定为94℃预变性2min,94℃变性30s,60℃退火30s;共40个循环;60℃退火30s。选择GAPDH作为内参，并计算2-ΔΔCT值进行表达量的相对定量计算。(2)取不同的3组细胞，离心后加入RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度是否合格，每孔取50μg总蛋白，加上样缓冲液后100℃变性5min，继续10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分裂，电泳后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭过夜，洗膜，按照次序加一抗、二抗，电化学发光显色，将其放置在暗室中进行显影，使用ImageJ软件对图像进行分析和比对，实验过程重复3次。

1.4.6RT-qPCR验证气道肉芽组织和正常气道黏膜组织中SOX9表达

将50对样本按照商品使用说明书用Trizol试剂从气道肉芽组织与正常气道黏膜组织中分别提总RNA，余下步骤与检测气道肉芽组织成纤维细胞中的SOX9mRNA相同。

1.4.7敲减SOX9基因对气道肉芽组织成纤维细胞增殖和凋亡的作用

细胞增殖实验检测:CCK8实验取对数生长期3组成纤维细胞，用0.25%胰酶将其消化并制备单细胞悬液，按照1×104个/孔浓度接种于96孔板，在培养箱孵育0、24、48、72h4个时点分别加入CCK8试剂10μl，继续孵育4h，酶标仪测定各组不同细胞在波长490nm处的吸光度值，每个实验组均设3个复孔，计算细胞生长抑制率，抑制率(%)=(1-实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%，培养板周围设置空白对照孔，实验重复实施3次;细胞凋亡检测:取对数生长期3组成纤维细胞，加入膜联蛋白V缓冲液500μl重悬细胞，按照膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭细胞凋亡试剂盒说明书检测各组细胞的凋亡情况。

1.5统计学方法

应用SPSS20.0统计软件对数据进行处理。计量资料以表示，组内比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析后的两两比较采用Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1基因芯片筛选出差异表达的mRNA和富集的信号通路

芯片检测结果提示:气道肉芽组织与气道正常黏膜组织中存在多种不同表达的mRNA。其中表达差异最明显的是SOX9基因(log2FC=3.667，调整后P<0.05)，差异基因富集最多的通路为Wnt信号通路。

2.2气道肉芽组织及正常气道黏膜组织中SOX9表达

分别运用RT-qPCR技术验证50份气道肉芽组织及50份正常气道黏膜组织中SOX9的表达差异，结果显示:在气道肉芽组织中SOX9mRNA的表达量为(6.4±1.7)，而在气道正常黏膜组织中为(2.7±0.8)，二者比较差异有统计学意义(t=14.340,P=0.003)。

2.3shRNA-SOX9慢病毒转染后SOX9及Wnt3a、β-连环蛋白、LEF1、TCF4表达

shRNA-SOX9组SOX9mRNA相对表达量为(0.57±0.08)，低于阴性对照组(1.42±0.12)和空白对照组(1.36±0.15)，差异有统计学意义(F=46.745,P=0.001);SOX9蛋白相对表达量减少至(0.38±0.07)，也同样低于阴性对照组(0.84±0.23)和空白对照组(0.90±0.15)(F=9.325,P=0.014)。shRNA-SOX9组Wnt3amRNA与阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义[(1.04±0.25)比(0.98±0.34)、(1.17±0.28)](F=0.312,P=0.744),Wnt3a蛋白3组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05);但β-连环蛋白、LEF1、TCF4的mRNA[(0.47±0.18)、(0.55±0.11)、(0.45±0.15)]均低于阴性对照组[(1.03±0.21)、(1.40±0.23)、(1.14±0.25)]和空白对照组[(1.18±0.15)、(1.25±0.18)、(1.18±0.19)]，差异均有统计学意义(F=12.870,P=0.006;F=18.810,P=0.002;F=12.640,P=0.007)，β-连环蛋白、LEF1、TCF4的蛋白表达也低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05);上述5个指标的表达在阴性对照组与空白对照组中差异均无统计学意义(均P>0.05)。相关蛋白表达情况见图1。

2.4shRNA-SOX9慢病毒转染后气道肉芽组织成纤维细胞增殖比较

气道肉芽组织成纤维细胞经shRNA-SOX9慢病毒转染24、48、72h后，shRNA-SOX9组气道肉芽组织成纤维细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.5shRNA-SOX9慢病毒转染后气道肉芽组织成纤维细胞的凋亡比较

以流式细胞术检测各组细胞凋亡率，结果显示shRNA-SOX9组细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组[(16.9±2.0)%比(9.1±1.2)%、(10.1±1.8)%],3组间差异有统计学意义(F=3.854,P=0.021)，空白对照组与阴性对照组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

3、讨论

SOX9与位于Y染色体上的SRY基因属于同源基因，位于17q24.3～q25.1，是一种影响胚胎早期发育的重要基因，在多种组织和器官的胚胎发育过程中表达，如肺、睾丸、心脏内膜、胰腺、毛囊、视网膜和中枢神经系统，具有性别决定、细胞分化、稳定干细胞分化等多种生理功能[6,7,8]。本研究对气道肉芽组织基因芯片筛选发现，SOX9在气道肉芽组织中也同样呈现高表达，且气道肉芽组织的差异基因主要富集在Wnt信号通路上，Wnt/β-连环蛋白是经典的信号通路途径，在细胞增殖、迁移和凋亡等过程中发挥着重要作用[9,10]。

本研究运用RT-qPCR技术验证了生物信息学分析的结果，发现气道肉芽组织与气道正常黏膜组织相比，SOX9呈现高表达。气道瘢痕的主要病理特征是气道肉芽组织成纤维细胞增殖异常和胶原分泌异常，其过度纤维化与细胞和细胞因子等因素相互作用密切相关，转化生长因子β1(TGF-β1)是目前已知瘢痕形成关系最密切，最具有代表性的生长因子，有研究表明TGF-β1可介导成纤维细胞中SOX9的上调促进肾脏纤维化瘢痕形成[11]，这也许可以解释气道肉芽组织中SOX9呈高表达的原因，但在气道瘢痕中TGF-β1对SOX9的调控作用仍需进一步实验加以验证。Scharf等[5]研究表明在小鼠心肌梗死后瘢痕中，SOX9表达上调，沉默SOX9后消除了心肌梗死后慢性期瘢痕形成过程中持续的炎症细胞浸润，其机制可能与Wnt/β信号通路有关。Wang等[12]研究也表明皮肤增生性瘢痕中，SOX9呈现过表达，可以促进胶原沉积及皮肤瘢痕成纤维细胞的增殖。气道狭窄的本质也是增生性瘢痕，与皮肤和心肌梗死后增生性瘢痕非常相似，都是在机体组织受到过度损伤的情况下发生了异常修复，导致了纤维组织过度增生[13,14]，本研究结果显示气道肉芽组织中SOX9也呈现高表达。

我们随后通过构建shRNA-SOX9慢病毒转染气道肉芽组织成纤维细胞，证明气道肉芽组织成纤维细胞在敲减SOX9基因后，Wnt/β-连环蛋白通路的上游蛋白Wnt3a的表达与对照组无明显差异，然而此通路的关键性蛋白β-连环蛋白及下游蛋白分子LEF1、TCF4的表达均有所下降。提示SOX9可能是通过调控β-连环蛋白，从而影响下游基因(LEF1和TCF4)的表达，导致气道瘢痕的形成。Wnt/β-连环蛋白是与成纤维细胞分化和生长密切相关的高度保守的信号通路，Li等[15]试验证明，气道狭窄组织中Wnt/β-连环蛋白被过度激活，该通路参与了成纤维细胞的分化和气道软骨的破坏，进而气道失去软骨直接的支撑，创面由肉芽瘢痕组织填充，出现气道的狭窄，而本研究进一步从体外细胞实验的层面验证了SOX9对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调控在气道瘢痕狭窄中的作用。在接下来的气道肉芽组织成纤维细胞增殖和凋亡变化检测中，本研究发现，敲减SOX9基因可以抑制气道肉芽组织成纤维细胞的增殖，而促进气道肉芽组织成纤维细胞的凋亡。这一现象可能是因为敲减了SOX9基因后，β-连环蛋白表达受到抑制有关。近年来，许多研究表明SOX9主要通过调控Wnt/β-连环蛋白通路影响胚胎发育及肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移。Joshi等[16]研究表明SOX9可以与β-连环蛋白结合后形成蛋白复合体，促进泛素/26S蛋白酶体途径的降解，从而促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的沉积。王秋琼等[17]研究发现非小细胞肺癌A549细胞的增殖和上皮-间充质转化与SOX9调控Wnt/β-连环蛋白途径相关。SOX9调控Wnt/β-连环蛋白信号通路可能在气道肉芽组织中也发挥着重要作用，直接影响着气道肉芽组织成纤维细胞的增殖和凋亡。但本研究仅进行了细胞实验层面的研究，对于SOX9对气道瘢痕的作用，在动物体内实验验证有待深入研究;同时，本研究只研究了SOX9敲减后对Wnt/β-连环蛋白信号通路的影响，未对SOX9过表达后对瘢痕机制的影响做深入研究，对于SOX9与β-连环蛋白在气道瘢痕中的具体结合机制可能也有其他转录因子参与，需进一步进行确认。

综上所述，SOX9在人气道肉芽组织中呈高表达，SOX9可能通过激活Wnt/β-连环蛋白信号途径促进气道肉芽组织成纤维细胞的增殖，抑制其凋亡。通过SOX9的研究有助于对气道狭窄的治疗提供一定的理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

文章来源：罗戈雯,张维,何杰.敲减SRY相关高迁移率族盒蛋白9基因下调Wnt/β-连环蛋白信号对气道肉芽组织成纤维细胞增殖和凋亡的影响[J].中国医药,2021,16(09):1397-1402.