周围神经损伤（PNI）在临床疾病中较为常见[1]，致残率较高[2]。随着我国国民生活水平逐步提高，患者对术后神经功能恢复的期待值很高。周围神经横断伤术后神经的再生在医学界仍然是个难题[3]。对周围神经横断伤患者神经功能的影响，除了损伤程度不同、手术时机的选取及医生的吻合技术外，最为重要的就是术后用药的选取。目前常用的药物有弥可保、鼠神经生长因子、腺苷钴胺等神经营养类药物[4]。但临床效果并不理想。我国传统医学具有悠久的历史，对于神经横断伤也拥有较长时间的研究，其治疗以补气活血、化瘀通络为基本治疗方法，效果显著。

临床中较为有效的方剂为补阳还五汤，使用较为广泛[5]。取其补气活血、化瘀通络之功效。其治疗PNI临床报道很多，对PNI恢复具有较好的促进作用。补阳还五汤对于大鼠坐骨神经损伤的基础类实验报道也较多[6]，既往的研究得出补阳还五汤对于坐骨神经损伤恢复具有良好的促进作用，提高神经的血供和改善微循环，可以改善大鼠坐骨神经损伤后的展趾功能，提高复合肌动作电位和神经干动作电位的波幅，提高小腿三头肌湿重恢复率，促进髓鞘再生[7,8,9]。还可以降低受伤坐骨神经中神经生长因子（NGF)mRNA在坐骨神经中的表达，以及可以提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3）的活性[10]。大量研究表明微管相关蛋白-2(MAP-2），神经丝蛋白（NF-M），生长相关蛋白-43(GAP-43）在神经再生中起到十分积极的作用。但还未有相关研究对补阳还五汤干预大鼠坐骨神经横断吻合术后，坐骨神经中MAP-2,NF-M,GAP-43蛋白的表达量进行研究。本研究就补阳还五汤对于大鼠坐骨神经横断吻合术后行为学及使用免疫组化和蛋白免疫印迹法（Westernblot）对MAP-2,NF-M,GAP-43表达量进行检测，进一步探究补阳还五汤促进大鼠坐骨神经横断吻合术后神经再生的机制，为临床合理用药提供依据。

1、材料

1.1动物

36只SD大鼠，体质量（200±20)g,SPF级，购于辽宁长生生物科技股份有限公司，合格证号SCXK(辽)2020-0001。于辽宁中医药大学实验中心喂养，自由取食取水。实验过程中处置方式均符合国家医学实验动物管理条例。本实验经过辽宁中医药大学实验动物管理委员会批准，并严格遵照相关规定进行。

1.2药物

补阳还五汤由黄芪（生）120g，当归尾6g，赤芍5g，地龙（去土）、川芎、红花、桃仁各3g组成。本实验药物选取中药饮片，所有中药饮片均采购于沈阳国大药房有限公司，并由辽宁中医药大学附属医院张锡玮教授鉴别均为正品。饮片分2次煎煮，第1次放入10倍的水进行煎煮，先武火煎煮，煮沸后改文火2h，过滤汤汁，留下药渣。第2次放入5倍清水，煎煮1h，纱布滤除饮片，弃去剩余药渣。将两次所得汤液混合放置于容器中。浓缩药汁质量浓度至含生药量2g·mL-1。放置于4℃冰箱中备用。弥可保（卫材中国药业有限公司，批号1904094）。

1.3试剂

NF-M抗体，MAP-2抗体，GAP-43抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab179870,ab5392,ab75810);PVDF膜（美国Lmmobilon公司，批号R6MA9195D）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号20090609）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝科技有限公司，批号G1120);4%多聚甲醛固定液（飞净生物科技有限公司，批号20201105);75%乙醇（吉林辉发生物科技有限公司，批号20200208);10%水合氯醛（中国Wabcan公司，批号20S09X20）；碘伏溶液（辽宁卫华医药有限公司，批号20180401）。

1.4仪器

CHA型生物显微镜，BX41型数码显微镜（日本Olympus公司）；HH·B11·500型电热恒温培养箱（北京医疗器械厂）；RM2235型切片机（德国Leica公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（英国Abcam公司，批号ab8227）。

2、方法

2.1模型的制备

假手术组沿坐骨神经体表处做手术切口，使用手术器械顿性分离，沿肌间隙进入，使用小拉钩轻轻牵开肌肉，暴露坐骨神经，将坐骨神经轻轻游离，大量生理盐水冲洗切口，缝合关闭切口。其余各组沿坐骨神经体表处做手术切口，使用器械顿性分离，沿肌间隙进入，使用小拉钩轻轻牵开肌肉，暴露坐骨神经，将坐骨神经轻轻游离，使用刀片切断坐骨神经，于显微镜下，使用8-0显微缝合线，端端缝合坐骨神经，缝合后坐骨神经连续性良好，每条坐骨神经缝合6针，神经无扭转，使用大量生理盐水冲洗切口，缝合关闭切口[11,12]。造模后大鼠该侧下肢瘫痪，1周后切口愈合良好无感染，即造模成功[13]。

2.2分组及给药

将36只大鼠随机分为6组，分别为假手术组，模型组，补阳还五汤高、中、低剂量组，弥可保组，每组6只。假手术组不行坐骨神经横断，仅游离大鼠坐骨神经，即关闭切口。其余5组大鼠均行坐骨神经横断吻合术。根据成人用药剂量与大鼠用药剂量转换[14]，大鼠每日摄入补阳还五汤高剂量溶液29.6g·kg-1；中剂量14.8g·kg-1；低剂量7.4g·kg-1；弥可保0.156mg·kg-1；模型组、假手术组给予等体积蒸馏水灌胃，灌胃4周，2次/d。

2.3指标检测

2.3.1行为学检测

大鼠造模成功后即进行补阳还五汤灌胃，4周后行斜板实验，测试其斜板角度[15]。自制坐骨神经功能指数仪器，测得大鼠健侧与患侧足迹的数据，代入经过改良的坐骨神经功能指数（SFI）公式，SFI=-38.3×（EPL-NPL）/NPL+109.5×（ETS-NTS）/NTS+13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8,EPL为伤侧足足印长度，NPL为正常足足印长度，ETS为伤侧足足趾宽度，NTS为正常足足趾宽度，EIT为伤侧足中间足趾宽度，NIT为正常足中间足趾宽度，以得到各组大鼠SFI[16]，衡量各组大鼠神经功能恢复情况。

2.3.2HE染色观察大鼠坐骨神经病理形态学变化

将干预4周后的大鼠坐骨神经取出，脱水后进行石蜡包埋，切片后行HE染色，将染好的切片放置于显微镜下观察，判断各组大鼠神经生长状况。

2.3.3免疫组化法检测坐骨神经中MAP-2,NF-M,GAP-43蛋白表达

将石蜡切片进行脱蜡，3%H2O2去离子水中孵育，滴加试剂A，滴加一抗，滴加试剂B，滴加试剂C。使用苏木素复染，再用盐酸乙醇分化。透明后，树脂胶封片，充分凝固后。在镜下选择染色均匀清晰区域进行图像采集和分析，每根坐骨神经选择3张切片，在显微镜下每张切片分别截取5个视野，截取的这5个视野中每个视野互不重叠。测定5个随机视野的平均光密度值，并以平均值为该样本中目的蛋白相对表达水平，进行统计分析。

2.3.4Westernblot检测坐骨神经中MAP-2,NF-M,GAP-43蛋白表达

对坐骨神经中的蛋白进行提取，测定蛋白含量，配置聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，之后转移凝胶中的蛋白至滤膜，使用去离子水清洗条带，5%BSA封闭液封闭1h。将膜置于NF-M抗体（1∶2000);MAP-2抗体（1∶2000);GAP-43抗体（1∶1000）中，4℃孵育过夜，室温复温2h,TBST缓冲液洗膜，然后孵育二抗（1∶2000),37℃孵育2h，再次洗膜。将PVDF膜放置在凝胶成像分析系统中，并在PVDF膜上滴加ECL工作液，调节曝光时间，采集图像，并以凝胶成像分析系统自带软件测定目的蛋白条带及内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达水平，进行统计分析。

2.4统计学方法

本实验数据均采用SPSS23.0软件处理，数据采用表示，多组间比较采取单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD），方差不齐选用非参数检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1对大鼠一般情况的影响

除假手术组以外，行坐骨神经横断吻合的各组大鼠均出现造模一侧肢体无力、踝下垂、跛行等神经损伤症状。除假手术组外各组大鼠均有足底溃疡的发生，其中补阳还五汤高剂量组最轻，模型组最严重，其余各组情况相似。各治疗组中补阳还五汤高剂量组大鼠精神状态最好。

3.2对大鼠斜板实验结果的影响

与假手术组比较，各组大鼠斜板实验角度均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高、中剂量组及弥可保组大鼠斜板实验角度均显著升高（P<0.01），与弥可保组比较，补阳还五汤高剂量组斜板实验角度显著升高（P<0.01）。补阳还五汤高剂量与中剂量对大鼠坐骨神经横断吻合术后神经功能恢复具有较为积极的作用。见表1。与假手术组比较，各组大鼠SFI均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠SFI均显著升高（P<0.01），补阳还五汤高、中剂量对大鼠坐骨神经横断吻合术后神经功能恢复具有较为积极的作用。见表1。

3.3对坐骨神经横断损伤大鼠形态学影响

HE染色结果显示，假手术组的坐骨神经内神经轴突、髓鞘连续性良好，存在数量较少的雪旺氏细胞；模型组内神经轴突以及雪旺氏细胞排列不规律不整齐，经治疗的各组神经轴突以及雪旺氏细胞排列情况：补阳还五汤高剂量组较好，弥可保组与低剂量组效果不明显。见图1。

3.4对坐骨神经横断损伤大鼠MAP-2,NF-M,GAP-43表达影响

免疫组化结果显示，MAP-2,NF-M,GAP-43在假手术组的坐骨神经中有少量表达，与假手术组比较，模型组中MAP-2,NF-M,GAP-43表达量显著增高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高、中、低剂量组及弥可保组MAP-2,NF-M,GAP-43表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）；与弥可保组比较，补阳还五汤高剂量组MAP-2,NF-M,GAP-43表达量显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表2，图2～4。

3.5对坐骨神经横断损伤大鼠相关蛋白表达的影响

MAP-2,NF-M,GAP-43在假手术组的坐骨神经中有少量表达，与假手术组比较，模型组MAP-2,NF-M,GAP-43表达量显著增高（P<0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高、中、低剂量组及弥可保组MAP-2,NF-M,GAP-43表达量明显增加（P<0.05,P<0.01）；与弥可保组比较，补阳还五汤高剂量组MAP-2,NF-M,GAP-43表达量显著升高（P<0.01）。见图5，表3。

4、讨论

PNI在临床中较为常见，随着生产水平的提高其患者数量在下降[17]。但我国人民生活水平不断提高，患者对于患肢术后功能具有较高的期望。神经吻合术包括：神经外模吻合术、神经束膜吻合术、神经黏合术、神经导管桥接术、自体神经移植术、异体神经移植术等[18]。随着我国医疗水平的整体提高，神经吻合技术已经被大多数外科医生所熟练掌握，术后用药的选择对于患肢神经功能的恢复起到了较为重要的作用。目前应用于神经横断伤术后的药物主要有以下几个种类。西药在神经损伤术后运用广泛，分为神经营养药物、外源性神经营养因子，Ca2+拮抗剂、激素[19]、免疫抑制剂FK-506等[20]。我国传统医学历史悠久，其中对于此类疾病也有较为深入的研究，传统中药就具有对于此类疾病较为有效的单味中药如牛膝、枸杞子、黄芪、丹参等[21,22]。对于神经损伤的方剂也较多，较为有代表性的方剂有：补阳还五汤、黄芪桂枝五物汤、补气通络汤等[23]。中国的针灸疗法对于神经功能的恢复也具有十分积极的作用[24]。其他治疗方法有电刺激治疗[25]、超短波治疗、高压氧治疗、氦氖激光治疗等[26,27]。对于神经横断损伤吻合术后中医药具有较为优秀的表现。其中补阳还五汤最为优异，临床应用较为广泛[28]。补阳还五汤记载在清朝著名医家王清任的《医林改错》[29]之中，由黄芪、赤芍、当归尾、地龙、红花、桃仁、川芎组成。具有补气、活血之功，舒筋通络的功效。本方中黄芪为君药，取其补益元气。重用生黄芪，气旺则血行，鼓动气血，以达到祛瘀通络的目的。臣药为当归（尾），当归尾活血通络，其特点为活血而不伤正。方中的川芎、赤芍、红花、桃仁协同当归活血通络祛瘀生新。方中地龙为佐药，其作用为通经活络。补阳还五汤具有补气活血通络的功效，原本用于中风等病症，但近些年来其对于周围神经损伤的治疗多有报道，显示出了可喜的疗效[30]。目前在临床中其也广泛用于治疗各种因素所造成的周围神经损伤[31,32]。周围神经损伤初期在中医属“伤筋”“痹证”范畴，为外邪内侵、气血瘀阻、经络不通，在手术后应当施以活血通络方药治疗，为神经肌腱血管的恢复创造良好的环境。在此类疾病中后期属于中医“萎证”范畴，机体气血不足、肢体筋脉肌肉失去濡养[33]。由于神经受损，经络不通造成所支配肢体萎软无力。因此在神经损伤的各个阶段应以补气活血、化瘀通络为基本治疗方法。

补阳还五汤虽然在创立方剂之初应用于中风等疾病，但其补气、活血之功，舒筋通络之功效正适用于周围神经损伤，所以近些年来使用其治疗周围神经损伤的临床、基础文献报道不断涌现。曾林如等[34]对其本院5年内78例断指再植成活患者分为3组，分别给予甲钴胺治疗，补阳还五汤治疗，甲钴胺联合补阳还五汤治疗。联合用药组临床疗效更佳。张远军等[35]对60例正中神经损伤术后患者进行随机分组，对照组给予弥可保治疗，治疗组给予补阳还五汤，连续治疗6个月，患者肢体感觉和M2-PD表达量优于弥可保组。谢国庆等[36]使用补阳还五汤对坐骨神经损伤大鼠进行治疗，随机分为补阳还五汤高、中、低剂量组、弥可保组、生理盐水阴性对照组，实验结论，补阳还五汤对于坐骨神经损伤大鼠展趾功能、复合肌动作电位和神经干动作电位波幅恢复具有积极作用。李淑彦等[37]运用补阳还五汤与理气散瘀汤对坐骨神经损伤大鼠进行干预，对大鼠足部温度进行测定，结果显示补阳还五汤组大鼠足部温度更高，说明补阳还五汤对于坐骨神经损伤大鼠神经恢复效果更佳。贲莹等[10]对不同剂量黄芪的补阳还五汤对于神经损伤大鼠进行干预，检测空腹血糖（FBG），坐骨神经传导速度、血液流变学变化，NGFmRNA表达水平和坐骨神经中Caspase-3活性，实验结果显示120g黄芪组大鼠神经恢复最好。大量优秀的基础类文献都证实补阳还五汤对于周围神经损伤具有优异的促神经再生的作用[38]。

本实验表明补阳还五汤对于大鼠坐骨神经横断损伤具有十分积极的作用，其可以增加大鼠坐骨神经吻合处的MAP-2,NF-M,GAP-43蛋白的表达，给与大鼠横断神经修复以更好的微环境，促进加速其修复、再生。本实验亦存在不足之处，所有坐骨神经模型均于一期进行神经吻合术，并未探讨一期清创缝合，二期行神经吻合，不能说明补阳还五汤是否对于二期吻合的神经亦具有积极的作用。期待更多更优秀的相关基础实验出现，使得补阳还五汤对周围神经损伤术后促神经再生的研究更加完善，更好的为临床用药提供理论依据。

文章来源：姚思成,马贤德,金连峰,王春田,陈崇民,张锡玮.补阳还五汤对大鼠坐骨神经横断吻合术后MAP-2,NF-M,GAP-43蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):23-30