多发性骨髓瘤(MM)是一种以骨髓中浆细胞单克隆增殖为特征的血液系统恶性肿瘤，发病率约占血液系统恶性肿瘤的10%[1],是目前第二常见的血液系统肿瘤[2]。虽然新型药物及免疫治疗的发展使MM患者的预后得到了极大的改善，但目前仍无法治愈[3]。自然杀伤(NK)细胞是一类具有强大自然杀伤活性的先天性免疫淋巴细胞，能够识别并消灭肿瘤细胞和病毒感染细胞，MM患者NK细胞的数量和功能均受到抑制，导致对骨髓瘤细胞的免疫监视和清除能力降低。NK细胞功能障碍的原因可能与骨髓微环境中的多种因素有关。恢复或增强NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用是MM免疫治疗的一个重要策略。本综述介绍NK细胞免疫功能，MM患者肿瘤微环境对NK细胞的影响，探讨NK细胞疗法应用于MM的未来发展前景。

1、NK细胞

NK细胞来源及分类

NK细胞是先天性免疫系统组成成分，属于先天淋巴细胞(ILC)家族，以非MHC限制的方式直接识别并消灭肿瘤细胞和病毒感染细胞，并间接改善抗体和T细胞介导的细胞免疫反应。NK细胞介导的细胞毒性和细胞因子释放影响其他先天免疫细胞的活性，并赋予NK细胞调节功能，影响抗原特异性、HLA限制性T和B细胞反应[4]。NK细胞起源于骨髓(BM)中CD34造血干细胞(HSC),在BM及次级淋巴器官如肝脏、扁桃体、淋巴结、胸腺中发育成熟并迁移到各解剖部位。NK细胞根据表面蛋白CD56和CD16的相对表达分为： CD56brightCD16+/-和CD56dim CD16bright。CD56bright NK细胞在外周血中数量较少，主要产生细胞因子起免疫调节作用。循环中90%的NK细胞是CD56dim,可以介导感染和/或恶性细胞的连续杀伤[5]。

NK细胞杀伤靶细胞的作用机制

NK细胞经刺激性受体激活后通过NK细胞介导的细胞毒性如Fas/FasL途径直接或通过促炎细胞因子如IFN-γ释放间接消除靶细胞。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用是靶向肿瘤细胞的另一种方法，直接释放颗粒酶和穿孔素，增加细胞膜通透性，引起靶细胞裂解。NK细胞通过细胞因子增强或减少巨噬细胞和T细胞的活性，调节巨噬细胞和T细胞反应杀死靶细胞[6]。

NK细胞受体及功能

NK细胞表达具有激活或抑制功能(或两者)的受体，通过受体信号输入的平衡产生对靶细胞细胞毒性的反应或耐受。激活性受体包括DNAM-1、CD16、NKG2D和天然细胞毒性受体(NCR)家族成员NKp30,NKp40,NKp44、NKp46和NKG2C[7]。NCR在NK细胞对靶细胞的细胞毒性起主要作用，调节先天性和适应性免疫反应。CD16是NK细胞表达的最有效激活受体，通过ADCC作用激活NK细胞[5]。NKG2D通过DAP10衔接蛋白转导激活信号；NKG2D可以识别在肿瘤细胞中上调的MICA/B和ULBPs, 肿瘤细胞脱落的可溶性NKG2D-L可能参与肿瘤逃逸机制[8]。NK细胞的抑制性受体包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)家族、C型凝集素家族成员NKG2A、程序性死亡受体-1(PD-1)、TIGIT、CD96、TIM-3和CD161[9]等。抑制受体可防止杀死正常细胞并限制NK细胞产生炎症细胞因子。KIR是跨膜糖蛋白家族的成员，存在于NK细胞表面，与靶细胞上的MHCI类分子结合，与配体结合抑制NK的细胞毒性作用并逃避免疫监视[10]。NKG2A为分化过程中表达的NKR,识别非经典HLA-E、NKG2A和HLA-E之间的相互作用导致NK细胞对所有HLA I类细胞的抑制。PD-1结合肿瘤细胞表达的配体 (PD-L1),健康个体的NK细胞几乎不表达PD-1,肿瘤部位可检测到高表达PD-1的NK细胞[8]。

2、MM患者的NK细胞

MM是一种骨髓恶性浆细胞肿瘤，骨髓瘤细胞与骨髓微环境的相互作用与MM的发生和进展有关，免疫功能失调在MM的发生和进展中起核心作用，免疫微环境受抑和免疫功能受损有利于恶性细胞存活并促进耐药性发生[11]。MM早期阶段MHCI和抑制性NK细胞配体在NK细胞上的表达降低，激活型受体的表达升高，促进NK细胞的细胞毒作用。随着疾病进展，NK细胞的抗MM功能逐渐受损，缺氧下调NKG2D和穿孔素/颗粒酶的表达，降低NK细胞的细胞毒性，研究发现，疾病晚期MM患者NK细胞数量和活性显著降低[12]。低NK细胞功能与MM患者的无病生存率较低有关，NK细胞表面CD56和CD16的上调表明出现具有高细胞毒性潜力的终末分化亚群，NK细胞介导的免疫功能随着疾病进展而进一步恶化[13]。微环境转化可能损害MM中的NK细胞效应功能，导致 NK 细胞毒性减弱和细胞因子产生。NK功能的变化包括激活受体的表达水平下调和NK细胞上PD-1表达上调，使得表达PD-L1的MM细胞抑制NK细胞的细胞毒性[14]。骨髓瘤细胞产生细胞因子如IL-6和IL-10,抑制IFN-γ和TNF-α的产生，影响NK细胞的增殖和功能，同时促进MM细胞存活并发展为耐NK细胞的肿瘤细胞[15]。NK细胞需要激活信号裂解靶细胞，MM细胞充分表达NKG2D,配体是MICA,随着疾病的进展，MICA从MM细胞表面脱落，NKG2D被内化，避免NK细胞通过此途径活化[16]。骨髓瘤细胞高度表达程序性死亡配体-1(PD-L1),PD-1/PD-L1相互作用抑制NK细胞反应。NK细胞作为抗肿瘤的第一道防线，其数量或功能变化影响MM发展及预后，骨髓微环境通过NK细胞激活或抑制性受体的调节影响NK细胞增殖及细胞毒性活性，因此增加NK细胞或改善其功能对MM患者有益。

3、NK细胞疗法

近年来免疫疗法快速发展，NK细胞作为人体免疫系统的“第一道防线”,直接识别并快速杀死靶细胞，无需抗原预敏和MHC限制。与T细胞相比，NK细胞缺乏TCR,NK细胞的抑制受体，如KIR可以阻止NK细胞攻击正常的宿主细胞[17],使NK细胞成为免疫治疗的理想候选者。自2002年以来，NK细胞的抗骨髓瘤作用已被Frohn等[12]证明，增加NK细胞数量或改善其功能是MM患者的潜在疗法。

细胞因子提高NK细胞活性和持久性

细胞因子影响NK细胞增殖并增加抗肿瘤细胞毒性，基于使用直接刺激和促进NK细胞激活、持久性和扩增的细胞因子的治疗方法已经在一些临床前和临床研究中得到测试[4]。

IL-15在刺激NK细胞扩增和细胞毒性功能中起重要作用。重组人IL-15(rhIL-15)作为单一药物给药应用于转移性恶性肿瘤患者的安全性和潜力的人体I期临床试验中，细胞因子释放(CRS)、巨噬细胞活化综合征以及 rhIL-15 的不稳定和早期肾清除限制其应用[18] 。NKTR-255是一种聚合物偶联的rhIL-15,Rafael等[13]用NKTR-255处理NK细胞，增强人NK细胞对MM细胞的抗肿瘤反应，NK活化受体和粘附分子表达上调同时增加NK细胞数量和ADCC作用及促炎细胞因子的释放，从而改善NK细胞介导的MM细胞杀伤。临床前研究支持NKTR-255作为NK细胞扩增和抗肿瘤功能的有效诱导剂，一项正在进行的1期开放性、多中心试验(NCT04136756)评估NKTR-255在复发或难治性MM治疗中的有效性及安全性，为其进一步评估MM的新型免疫治疗方法提供了依据。

IL-18刺激NK细胞扩增并改变其表型，已经开发了几种表达NK细胞活化信号(562-4BBL,OX1L)和细胞因子(mbIL-40,mbIL-15)的GE-K21饲养层细胞系，离体扩增并产生高度活化的NK细胞。Thangaraj等[19]研究开发了一种表达IL-18/IL-21和OX40L的膜结合形式的新型K562细胞系(K562-OX40L-mbIL-18/-21),该细胞明显增强NK细胞的扩增，增加激活信号，并增强其对MM细胞的细胞溶解活性。该研究证实由K562-OX40L-mbIL-18/-21细胞刺激MM患者产生NK细胞可能是一种潜在的MM治疗方法。

NK细胞与IL-12,IL-15和IL-18的孵育产生细胞因子诱导的记忆样(CIML)NK细胞，CIMLNK细胞对细胞因子再刺激的激活阈值较低[20]。Shapiro等[21]研究证明供体来源的CIMLNK细胞输注到免疫相容的环境中以管理骨髓恶性肿瘤HCT后复发耐受性良好且安全，实现NK细胞的快速扩增和提高体内持久性。临床前研究证实NK细胞在抗肿瘤防御中起着相关作用，细胞因子受体信号可以调节激活和抑制受体的表达，细胞因子刺激NK细胞活化和增殖，增强细胞毒性，未来需要进一步临床实验明确其使用方式、有效性及安全性。

NK细胞过继疗法

过继性NK细胞输注在治疗血液恶性肿瘤方面具有可行性、有效性和安全性。在MM中使用NK细胞治疗的临床研究有限。自体NK细胞治疗，通过白细胞去除术从患者体内获得NK细胞，离体激活和扩增后返回患者体内。自体NK细胞输注已被证明是安全且可耐受的，然而自体NK细胞过继移植的临床应用有限且NK细胞的抗肿瘤作用降低[22]。同种异体NK细胞来源有脐带血(UCB)、外周血(PB)、人胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(iPSC),以及同源NK细胞系如NK-92。一些研究报道了MM患者离体扩增、活化和输注自体NK细胞的可行性。Chang等[23]从新诊断MM患者的外周血单核细胞(PBMC)离体扩增NK细胞，在不裂解正常细胞的情况下消除了MM细胞，表明扩增/活化NK细胞可能在未来治疗MM中发挥作用。一项多发性骨髓瘤的1/2期研究中，输注脐带血扩增的NK(UCB-NK)细胞联合自体干细胞移植获得了有希望的结果[24],UCB-NK细胞表现出比PB-NK细胞更高的细胞毒性活性，可应用于MM治疗[12]。开发UCB作为NK细胞治疗的来源的临床实验正在进行(NCT01729091)。NK-92细胞系在多种肿瘤中显示出抗肿瘤活性，在临床前研究中表现出良好效果，NK-92细胞系已获得FDA批准用于临床试验[25]。Williams等[26]使用NK-92细胞系进行了一项I期剂量递增试验，纳入5名HSCT后复发的MM患者，高剂量辐照NK-92输注安全，耐受性良好且无毒，5例患者中1例达到CR,3例患者仍存活，表明NK-92细胞系可能对难治性MM有效。iPSC显示出长期的储存能力，并在扩增过程中表现出自我更新的特性，iPSC来源的NK细胞具有基因工程的相对容易性、基因修饰后的克隆选择以及无需限制采集时间的优点[17]。iPSC衍生的NK细胞在血液系统疾病治疗的临床试验中观察到有希望的结果，治疗MM的临床试验正在进行[27]。同种异体NK细胞疗法具有多种优势，移植物抗宿主病(GVHD)发生率低，安全性较高，无需等待数周回输，NK细胞的每个组织来源具有优势和挑战，需要进一步临床实验确定其应用。

CAR-NK疗法

CAR-NK细胞疗法具有安全性高、成本低和抗肿瘤潜力高等有利特征。CAR-NK细胞相对于过继疗法安全，不介导并可能降低GVHD,CRS和肿瘤溶解综合征相对较少，CAR-NK细胞可检测MHCI类阴性肿瘤细胞，减少肿瘤逃逸，同时NK细胞可识别正常与肿瘤细胞，杀死靶细胞的同时避免正常细胞受到损害[6]。因此CAR-NK细胞在治疗MM方面具有多重优势。FT555是一种GRPC5D CAR-NK细胞， 在MM小鼠模型中，FT555显示出强大的肿瘤清除能力，与daratumumab联合明显提高抗MM活性并且防止daratumumab介导的自相残杀。临床前研究表明BCMA/GRPC5D双CAR-NK细胞在MM模型中的抗肿瘤功效有所提高[28]。Karvouni等[29]已证明来自MM患者的αCD38-CAR-NK细胞在离体时对自体MM样品的活性增加，构建αCD38-CAR-NK细胞为治疗MM患者提供有效且可行的免疫治疗策略。一项正在进行的I期试验中，9例接受CAR-NK细胞输注的MM患者均未观察到CRS或免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS),1例单用CAR-NK细胞治疗的患者获得了非常好的部分缓解(very good partial response, VGPR),2名患者在输注CAR-NK细胞和daratumumab后获得缓解，证实CAR-NK疗法的有效性及安全性[28]。综上所述，CAR-NK细胞疗法具有强大的应用前景，目前处于起步阶段，CAR-NK细胞存在生产成本高，缺乏有效靶标等问题，需要更多的研究来设计用于治疗MM的CAR-NK细胞，同时需要临床数据支持并克服CAR-NK细胞疗法的不足，针对MM治疗的临床实验正在进行(NCT03940833,NCT05008536,NCT05008536)[30]。

去唾液酸化增强NK细胞功能

异常糖基化是癌症的标志，肿瘤细胞的外表面附着唾液酸过多，通过唾液酸转移酶清除[31],唾液酸转移酶在癌症中经常失调，几种唾液酸转移酶与MM的疾病进展和预后有关，唾液酸过高可导致肿瘤细胞转移及耐药，同时导致免疫逃避，包括抑制NK细胞介导的免疫监视[32]。肿瘤细胞上的部分唾液酸化聚糖与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)结合，Siglec与其同源配体相互作用后抑制细胞毒性和/或细胞因子的产生，NK细胞表达抑制受体Siglec-7和Siglec-9[31]。Daly等[32]研究证实肿瘤细胞的高唾液酸化有助于MM细胞逃避NK细胞的免疫监视，去唾液酸化是消除MM细胞上的唾液酸并增强NK细胞介导的细胞毒性的有效策略。去唾液酸化增强抗CD38单克隆抗体daratumumab处理后NK细胞对CD38 MM细胞的细胞毒性，使用CRISPR/Cas7靶向删除抑制性Siglec-7受体可增强NK细胞介导的细胞毒性。MM细胞去唾液酸化是一种有前途的新方法，通过降低唾液酸抑制MM细胞转移，减少免疫逃逸从而增强NK细胞对MM的功效，与一线疗法结合提高有效的抗MM反应。

4、结语

近年来免疫疗法在血液系统恶性肿瘤治疗方面取得了巨大进展，免疫疗法明显减轻细胞毒性化疗的全身毒性，NK细胞参与骨髓瘤细胞的识别及杀伤，阻止免疫逃逸机制，在MM患者中可检测到NK细胞衰老耗竭与功能受抑，影响肿瘤监视及骨髓瘤细胞清除，增加体内NK细胞数量或增强内源性NK细胞功能和持久性是治疗的关键。细胞因子刺激NK细胞增殖并增强功能，临床前及临床研究证明NK细胞过继疗法效果和可行性，开发CAR-NK可能是治疗MM的有效策略。大多数NK细胞产品仍处于早期临床前探索阶段，不可否认的是NK细胞疗法在MM免疫治疗中具有广阔的应用前景，未来为MM患者的治疗提供更多的选择。

参考文献:

[3]孙春艳,房佰俊,高广勋,等.塞利尼索联合化疗方案在复发/难治性多发性骨髓瘤治疗中的探索—来自多中心､开放标签的LAUNCH研究中期数据结果.临床血液学杂志,2023,36(7):468-472.

[30]唐文娇,李燕,郑宇欢,等.嵌合抗原受体自然杀伤细胞免疫治疗多发性骨髓瘤研究进展.中国医学科学院学报,2023,45(2):290-297.

文章来源:韩帆,席亚明.NK细胞疗法在多发性骨髓瘤治疗中的研究进展[J].中国实验血液学杂志,2024,32(01):297-301.