多发性骨髓瘤（MM）是临床常见的浆细胞恶性肿瘤[1]。在MM恶性增殖的过程中，细胞内累积大量异常免疫球蛋白，使内质网应激增强，继而激发未折叠蛋白反应[2]。硼替佐米可阻止蛋白质的降解，增加细胞内的蛋白质负荷，加重内质网应激，引发细胞凋亡，但继发性耐药的出现给该药的临床应用带来了很大的挑战[3]。研究表明，在内质网应激过程中IRE1α-XBP1通路可能与MM耐药密切相关[4]。敲除XBP1或IRE1α抑制剂能抑制MM细胞增殖，增强硼替佐米的敏感性[5,6]。因此，IRE1α-XBP1通路累及的关键节点及调控因子有望成为MM治疗及克服耐药的新靶点。

烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）作为肿瘤代谢研究中的一个热点，已在大部分肿瘤中被证实具有促癌作用，是一个有前景的肿瘤治疗靶点[7]。Cea等[8]研究发现一种特异性的NAMPT抑制剂APO866通过抑制m TORC1/Akt和ERK1/2通路诱导MM细胞自噬。然而，Cagnetta等[9]研究表明，APO866可诱导内质网应激增强化疗药物的抗肿瘤活性。NAMPT抑制剂激活的细胞死亡程序发生改变，优先激活细胞凋亡和内质网应激，提示NAMPT可能参与内质网应激介导的MM细胞耐药。本课题组前期观察到NAMPT高表达可能导致MM患者硼替佐米耐药，与不良临床特征、疗效、预后有关。因此，在应用硼替佐米的同时，抑制NAMPT表达能否进一步提高疗效是值得关注的一个问题。本研究探讨NAMPT在MM发生发展和硼替佐米耐药中的作用及机制，旨在为临床转化提供理论依据。

一、材料与方法

试剂与仪器

PCR引物由上海美轩生物科技有限公司合成，CCK-8细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，染色质免疫共沉淀试剂盒购自美国Millipore公司，LipofectamineTM 3000转染试剂购自美国Thermo Fisher公司，总RNA提取试剂盒、NAMPT干扰质粒、阴性对照质粒均购自上海美轩生物科技有限公司，质粒p Max GFP购自德国Amaxa公司，限制性内切酶、逆转录病毒表达载体p BABE、质粒提取试剂盒均购自美国Axygen公司，兔抗NAMPT、BAX、BCL-2、Caspase-3、β-actin抗体均购自英国Abcam公司，注射用硼替佐米购自江苏豪森药业集团有限公司，MKC3946购自美国Sigma公司，二甲基亚砜购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。离心机为德国Eppendorf公司产品，PCR仪为美国Bio-Rad公司产品。

对照样本收集

采集的骨髓标本来自2018年12月-2020年10月山西医科大学第二医院血液科的15例健康造血干细胞移植供者，包括男11例，女4例，中位年龄46(37-55）岁。所有受试者均知情同意。

骨髓单个核细胞培养

从采集的骨髓标本中分离单个核细胞。置于补充有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞密度为2×106/ml，接种于培养瓶，在含有5%CO2的37℃的潮湿培养箱中培养，在培养d3收集细胞备用。台盼蓝染色，细胞存活率在97%以上，调整细胞密度为1×106/ml接种于25 ml培养瓶，每瓶接种5 ml。

骨髓瘤细胞系

人MM细胞系U266、RPMI-8226细胞为本实验室保存株。人MM细胞系MM1R和MM1S细胞由北京陆道培医院赠送。常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞每2-3 d传代。取对数生长期的细胞进行实验。

RT-qPCR实验检测目的基因m RNA的表达水平

采用RNeasy Mini试剂盒分离RNA，使用引物扩增c DNA，使用SYBR green q PCR试剂盒检测目的基因m RNA的表达。独立实验一式3份。使用Primer5.0软件设计RT-q PCR引物，经BLAST进行同源检索后，由上海美轩生物科技有限公司合成引物，使用β-actin引物作为内部对照（表1）。

Western blot法检测目的蛋白的表达水平

收集各组细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白质，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。使用目的蛋白一抗，使用辣根氧化物酶偶联的抗兔二抗。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并在4℃过夜检测印迹。保存图像，对各条带灰度值使用Image Tool 3.00图像分析软件进行分析，计算目的蛋白条带灰度值/管家基因蛋白条带灰度值。

细胞转染

取对数生长期的该细胞以每孔5×105个细胞接种于无菌6孔板中，依据说明书将NAMPT Si RNA、XBP1Si RNA或相应的阴性对照（scrambled Si RNA）经LipofectamineTM 3000转染U266细胞，放置在37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。转染24 h后收集细胞，采用Western blot法检测目的基因的表达水平。Si RNA序列及其对应的核苷酸结合位点见表2。

逆转录病毒稳定过表达基因

设计引物克隆Flag-NAMPT、Flag-XBP1，连接到p BABE载体上，构建p BABE-Flag-NAMPT及p BABE-Flag-XBP1重组质粒，并交上海美轩生物科技有限公司完成测序。包装HEK293T细胞，调整细胞密度约80%，转染30μg质粒，转染后24 h弃去转染液，同时加入20%的胎牛血清，换液培养24 h。收集病毒上清，室温高速离心5 min，弃沉淀，将上清和等体积的培养基共同加入到U266细胞中，同时加入浓度为8μg/ml的polybrene，培养24 h。换含10%胎牛血清的细胞培养液继续培养24 h，加入浓度为5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，去除未被感染上或感染后未存活的细胞。Western blot方法验证目的基因稳定过表达效果。

CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的细胞制成细胞浓度为5×104/ml的细胞悬液，在96孔板中接种单细胞悬液（每孔100μl），置于培养箱中培养24、48、72 h。结束培养后，向每孔加入10μl的CCK-8溶液。将培养板置于培养箱内孵育4 h。在酶标仪上选择450 nm波长，测定各孔的吸光度值（OD450），记录并分析。

流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板。加入适当终浓度的处理药物。培养48 h后收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2次，1 000×g离心5min。弃上清，重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC、10μl碘化丙啶染色液轻轻混匀，室温避光孵育20min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

染色质免疫共沉淀实验

经过甲醛固定→染色质提取→超声波片段化→免疫共沉淀→解交联→DNA纯化步骤，用回收得到的DNA为模板，设计引物行PCR实验。

统计学方法

每个实验至少重复3次。采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，方差齐者，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差不齐则应用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

MM细胞系和正常骨髓细胞中NAMPT m RNA水平比较

MM细胞系（MM1R、MM1S、U266、RPMI8226）中NAMPT m RNA水平较正常骨髓单个核细胞均显著升高（P<0.001），且在U266细胞中表达量最高，因此，后续细胞实验采用U266细胞来进行研究（图1）。

MM细胞系和正常骨髓细胞中NAMPT蛋白水平比较

Western blot检测以上样本中NAMPT的蛋白表达水平，结果显示，与正常骨髓单个核细胞相比，4组MM细胞系中NAMPT蛋白表达水平均显著升高（P<0.001）（图2）。

U266细胞中稳定敲除NAMPT效果检测

在U266细胞中稳定转染Si RNA-NAMPT和Si RNA-NC，结果发现超过80%的细胞在转染后24 h表达绿色荧光信号，表明转染成功（图3）。Si-NAMPT组NAMPT蛋白表达水平为0.22±0.06，与Si-NC组的0.89±0.06比较显著降低（P<0.001）（图4）。

稳定敲除NAMPT对U266细胞增殖的影响

CCK-8法检测细胞增殖能力，结果显示，转染24、48、72 h后，与Si-NC组相比，Si-NAMPT组U266细胞增殖抑制作用显著增加（P=0.006,P<0.001,P=0.001）（图5）。

稳定敲除NAMPT对U266细胞凋亡的影响

流式细胞术检测NAMPT基因敲除对U266细胞凋亡的影响，结果显示，与Si-NC组比较，Si-NAMPT组作用48 h时细胞凋亡率显著升高（P<0.001）（图6）。

U266细胞中过表达NAMPT效果检测

将Flag-NAMPT重组质粒及空载体Flag分别转染到U266细胞中，采用Western blot方法分析其过表达效果，结果显示，与Flag-NC组相比，Flag-NAMPT组NAMPT蛋白表达水平显著升高（P<0.001）（图7）。

过表达NAMPT对U266细胞增殖的影响

采用CCK-8法检测细胞增殖能力，结果显示，转染24、48、72 h后，与Flag-NC组相比，Flag-NAMPT组细胞增殖均显著升高（P=0.003,P=0.002,P<0.001）（图8）。

过表达NAMPT对U266细胞凋亡的影响

采用流式细胞术检测过表达NAMPT对U266细胞凋亡的影响，结果显示，与对照组相比，Flag-NAMPT组细胞凋亡率显著降低（P<0.001）（图9）。

JASPAR数据库分析NAMPT的基因组上游调控序列

NCBI-Gene数据库中NAMPT在基因组的位置为Chr7:106248298-106284983，启动子区域为Chr7:106284884-106286983。打开JASPAR数据库（https://jaspar.genereg.net），输入启动子区序列，结果在NAMPT的启动子区域1913-1926 bp处发现一个潜在保守的XBP1结合位点。染色质免疫共沉淀实验结果表明，在U266细胞中内源的XBP1能和之前预测的NAMPT基因上游XBP1结合位点特异性结合（图10）。

过表达XBP1后NAMPT m RNA水平检测

Western blot结果显示，与Flag-NC组比较，Flag-XBP1组XBP1蛋白表达水平显著升高。RT-q PCR结果显示，与Flag-NC组相比，Flag-XBP1组的NAMPT m RNA水平显著上调（P<0.001）（图11）。

稳定敲除XBP1后NAMPT m RNA水平检测

用Western blot方法验证其敲除效果，结果显示，与Si-NC组比较，Si-XBP1组XBP1蛋白表达水平显著降低。RT-q PCR结果显示，与Si-NC组相比，稳定敲除XBP1基因后NAMPT m RNA水平显著下调（P<0.001）（图12）。

抑制IRE1α-XBP1-NAMPT轴的U266细胞在硼替佐米处理后细胞增殖检测

分别将XBP1-Si RNA、NAMPT-Si RNA及阴性对照Si RNA转染到U266细胞中培养24 h，再用硼替佐米（10 nmol/L）处理24 h，采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果显示，与Si-NC组相比，稳定敲除XBP1或NAMPT的U266细胞在硼替佐米处理后，细胞增殖率显著下降（P<0.001）（图13A）。

以二甲基亚砜为阴性对照组，使用IRE1α抑制剂MKC3946(10μmol/L）预处理U266细胞4 h，再用硼替佐米（10 nmol/L）处理24 h，采用CCK-8法测定细胞增殖情况，结果显示，MKC3946处理后的U266细胞在硼替佐米作用后细胞增殖率显著下降（P<0.001）（图13B）。

抑制IRE1α-XBP1-NAMPT轴的U266细胞在硼替佐米处理后凋亡敏感性检测

采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因BCL-2和BAX m RNA和蛋白表达量，采用Caspase-3/7分析试剂盒对Caspase-3/7活性进行分析。结果显示，与对照组相比，稳定敲除XBP1、NAMPT和经MKC3946预处理的U266细胞在硼替佐米处理后，BAX m RNA和蛋白水平显著升高，BCL-2 m RNA和蛋白水平显著下调，Caspase-3裂解度显著下降，Caspase-3/7活性的急剧增加，比较差异均有统计学意义（P<0.05）（图14）。

三、讨论

目前，蛋白酶体抑制剂硼替佐米已广泛应用于新诊断和复发/难治性MM患者。然而，硼替佐米长期治疗可能会导致累积毒性和获得耐药性，是目前临床MM治疗的难题之一[10]。本课题组前期观察到NAMPT高表达可能导致MM患者硼替佐米耐药，且与MM患者的不良临床特征、疗效、预后有关。因此，有必要进一步研究NAMPT在MM发生发展和硼替佐米耐药中的作用及机制。

为了明确NAMPT在MM细胞系中的表达情况，本研究以正常骨髓单个核细胞为对照，结果显示，MM细胞系MM1R、MM1S、U266、RPMI-8226中NAMPT m RNA和蛋白水平均显著上调。Venkateshaiah等[11]证明了NAMPT在大多数MM原代细胞、MM细胞系中上调，本研究结果与文献报道一致，提示NAMPT的表达上调可能在MM的发生中发挥作用。本研究结果显示，NAMPT基因稳定敲除可抑制U266细胞的增殖，诱导细胞凋亡，而NAMPT基因过表达可显著促进细胞增殖，抑制凋亡，表明NAMPT对MM细胞生存起到至关重要的作用。Cagnetta等[12]研究结果表明，NAMPT特异性化学抑制剂APO866在MM细胞系和患者MM细胞中触发细胞毒性。Venkateshaiah等[11]证明，APO866或NAMPT基因敲除在体外和体内均显著降低了MM细胞的存活期和生长活性。本研究结果证实了NAMPT在MM生物学中的关键作用，为新的靶向治疗提供了基础。

研究表明，NAMPT表达的变化是随着对靶向治疗产生耐药性而发生的[13]。Cagnetta等[9]研究发现，APO866通过诱导白血病细胞内质网应激来提高Pgp抑制剂的抗肿瘤活性，证明了内质网应激在APO866和Pgp抑制剂的协同作用中发挥关键作用。值得注意的是，这与之前APO866单药治疗观察到的自噬性细胞死亡不同[8],NAMPT抑制剂激活的细胞死亡程序发生改变，优先激活细胞凋亡和内质网应激，提示NAMPT可能参与内质网应激介导的MM细胞耐药。MM细胞具有高度发达的内质网相关蛋白降解系统，通过该系统，错误折叠的蛋白质被排除在内质网之外，并在蛋白酶体上被水解[14]。然而，硼替佐米等蛋白酶体抑制将破坏该系统平衡，进而导致内质网的过度应激和MM细胞凋亡的顺序进展。因此，假定在应用硼替佐米增强内质网应激介导的促死亡通路的基础上，再抑制未折叠蛋白反应介导的促生存通路[15]，可进一步增强硼替佐米的敏感性。

IRE1-XBP1通路在未折叠蛋白反应中具有促生存作用[15]。XBP1是在癌症治疗中靶向未折叠蛋白反应途径最有前途的靶点之一，尤其是在MM细胞中，因为XBP1是产生浆细胞所必需的，在MM中高度表达，且与生存率低有关[16]。转录因子XBP1对NAMPT的调控未在MM中得到过证实。染色质免疫共沉淀实验证实XBP1基因和NAMPT启动子区的基因片段存在特异性结合。本研究为了进一步探索这种特异性的结合能否产生效应，从正反两个方面来进行证实。在U266细胞中稳定敲除XBP1基因后NAMPT m RNA水平显著下调，相反，过表达XBP1基因后NAMPT m RNA水平显著上调，这进一步证实NAMPT的高表达可能与XBP1介导的转录上调有关。为了进一步验证XBP1介导的NAMPT转录上调在MM耐药中是否有作用，用硼替佐米处理稳定敲除XBP1或NAMPT的U266细胞，发现其细胞增殖率显著下降，细胞凋亡显著升高，表明XBP1对NAMPT的异常调控在MM的发生发展及硼替佐米耐药中发挥了一定的促进作用，而XBP1的表达受到IRE1α-XBP1通路的影响。IRE1α-XBP1通路参与调控了肿瘤发生发展的各个阶段，对IRE1α通路严密调控可作为肿瘤治疗的有效手段[4]。与非耐药的乳腺癌细胞相比，耐药的乳腺癌细胞XBP1m RNA和蛋白水平上调，STF-083010处理后重新建立了耐药乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性[17]。另一种IRE1α的小分子抑制剂MKC3946，通过抑制XBP1的剪接抑制了MM细胞的生长，并且增强了硼替佐米诱导的细胞凋亡[18]。以上研究表明，靶向阻断IRE1α-XBP1信号通路可能是一种潜在的抗癌治疗策略。本研究中MKC3946抑制IRE1α-XBP1通路后，同样表现为U266细胞对硼替佐米治疗的敏感性显著增强，提示IRE1α-XBP1-NAMPT轴可能参与了U266细胞对硼替佐米的敏感性调节，这为制定硼替佐米耐药的MM患者的治疗策略提供了新的方向。

综上所述，本研究通过体外实验探讨了NAMPT在MM增殖、凋亡及硼替佐米耐药中的可能机制及相关通路的异常调控，提示IRE1α-XBP1-NAMPT轴可能参与了MM的发病及耐药，为MM的靶向治疗提供了新思路。后续研究可以在其他MM细胞中进行验证，并在动物实验中重复研究结果，以证明体内的信号转导和体外实验的一致性。

参考文献:

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[14]张旭明,王胜超,黄尤光.内质网应激与肿瘤关系的研究进展.生命的化学,2018,38(5):743-748.

[15]王安琪,孙国平.内质网应激在抗肿瘤治疗中的作用及研究进展.中国药理学报,2021,37(12):1643-1647.

基金资助:山西省重点研发计划项目(201903D321099);

文章来源:王亚茹,马艳萍.NAMPT在多发性骨髓瘤中的作用机制及其临床意义[J].中国实验血液学杂志,2024,32(01):138-145.