至今为止，恶性肿瘤仍是世界范围内主要死因之一，并且是提高人口预期寿命的重要障碍。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)2019年估计，世界上183个国家中112个国家70岁前死亡的第一或第二大原因是肿瘤，其全球发病率和死亡率目前还在持续增长[1]。在我国，肿瘤是我国人口主要死因之一，也是最常见的慢性疾病之一。根据中国国家癌症中心(China National Cancer Center, NCC)的估计，2016年约406.4万例新发癌症病例，预估粗发病率为293.9/10万，大大高于全球平均发病率[2]。因此，越来越多研究致力于寻找合适的药物和疗法以延长肿瘤患者寿命。肿瘤药物的开发依赖于合适的临床前研究模型，先前的研究通常使用肿瘤细胞系、基因工程小鼠和患者来源的肿瘤异种移植模型(patient-derived xenografts, PDXs),但这些模型各有优劣。目前最大障碍之一就是现有研究模型与患者肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)间均有较大差异[3]。随着生物医学工程和合成生物化学的发展，目前已逐渐开发出合适的培养条件，更加精确地模拟TME对肿瘤生长过程中的影响。在短时间内高通量生成高度模拟肿瘤特性的类器官并量化其生长情况，极大地提高了药物研发和筛选的准确性和有效性。

本综述重点关注了患者来源的肿瘤类器官培养技术及应用的新进展。介绍了相比于传统类器官培养技术在工程学方面的改进及优势，总结了肿瘤类器官在基础和转化肿瘤研究及临床治疗中的最新应用进展，最后讨论了目前肿瘤类器官培养的局限性及关键挑战，并展望其未来广泛的应用前景。

1、肿瘤研究模型的优劣

自1953年Hela细胞系建立以来，永生化肿瘤细胞系被广泛用于基础分子生物学和转化医学研究[4]。肿瘤细胞系培养简单，经济高效，保留了来源肿瘤的一些生物学特征，可进行基因操纵和被诱导分化，被广泛应用于各种肿瘤研究。然而，肿瘤细胞系被广泛传代，基因突变积累较多，存在克隆选择性，无法模拟肿瘤异质性[5]。更重要的是无法模拟肿瘤微环境与肿瘤细胞间的相互作用，且缺乏与永生化肿瘤细胞系相匹配的患者来源正常组织细胞系[6],这些都限制了其应用价值。PDXs模型是将患者肿瘤细胞皮下或原位移植到免疫缺陷动物体内，能够再现肿瘤微环境的某些方面，已被用于研究药物耐药性和开发新疗法[7]。但PDXs模型建立耗时费力，成本较高，较难进行基因操纵[8]。此外，患者来源的肿瘤细胞被注射到动物模型后需要适应新的环境，会导致基因漂移使模型精度降低[9]。相比之下，构建体外三维(three dimensional, 3D)肿瘤模型成为一种可以在体外重现肿瘤病理生理学特征的新兴方法，其中球状体和类器官是3D组织模型的两种主要类型。球状体是悬浮培养的细胞团聚集体，可来自细胞系、原代细胞或组织[10],比2D细胞培养能更好地模拟肿瘤的行为，已应用于研究肿瘤生长、血管生成和药物耐药性[11]。然而，肿瘤球状体在细胞组成和细胞间相互作用方面不能较好模拟肿瘤生长情况，且其生长大小有一定限制，阻碍了其临床应用[12]。类器官是体外培养的可模拟体内器官组织结构及某些功能的3D模型，可来源于原代组织样本、胚胎干细胞、多能干细胞或成体干细胞，形成包含多个组织特异性细胞类型的与来源组织相似的结构。肿瘤类器官即为来源于患者特定肿瘤组织样本的3D自组织结构，可模拟亲本肿瘤的关键组织病理学、遗传学和表型特征，并可模拟部分肿瘤微环境，有助于在肿瘤细胞-细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相互作用的情况下评估药物耐药性，并大规模培养用于高通量药物筛选[6]。此外，它不需要适应新的宿主，避免了基因漂移[13]。类器官成为了一种更快速、更经济方便的研究模型，可填补细胞系模型和动物模型之间的空白[14]。

2、传统肿瘤类器官培养技术

2.1肿瘤类器官发展历史

类器官培养技术的兴起和发展与多项重要发现密切相关：1952年MOSCONA等人[15]和1960年WEISS等人[16]观察到被打散的单个鸡胚细胞可以重新聚集成组织样结构，1975年RHEINWALD等人将人原代角质形成细胞与3T3细胞共培养，第一次观察到类似人表皮结构的克隆形成[17],1987年LI等人模拟体内环境改善细胞培养条件，发现在engelbreth-holm-swarm(EHS)小鼠肉瘤ECM提取物上生长的乳腺上皮细胞可以分化出乳腺导管等3D结构，并能合成和分泌乳蛋白[18]。1995年STREULI等人发现ECM不仅有支撑作用，其中的层黏连蛋白等成分还可通过整合素-黏着斑相互作用调控基因表达[19]。最终，2009年CLEVERS团队从小鼠小肠隐窝分离出Lgr5+干细胞，在富含层黏连蛋白α1/α2的基质上，加入肠细胞增殖和分化关键细胞因子R-spondin1/EGF/Noggin,培养出有分化形态的类似于原始小肠组织的隐窝样结构，这是首次在体外培养出类器官[20]。基于此，2011年该团队又首次从患者来源的结直肠癌等组织中成功培养出肿瘤类器官[21],此后多个研究小组迅速开发出多种肿瘤类器官模型，并证明类器官比细胞系更能反应原始肿瘤的特征[22],肿瘤类器官开始逐渐成为研究肿瘤发生机制、开发药物及探索个性化治疗方法的重要临床前研究模型。

2.2传统培养技术及局限性

基于干细胞来源的类器官培养经验，研究者开发出了传统肿瘤类器官培养方法。传统肿瘤类器官培养通常是将患者来源的肿瘤组织、细胞或基因工程编辑后的干细胞种植于细胞外基质，添加含有各种生长因子的无血清基础DMEM/F12培养基。迄今为止，传统肿瘤类器官培养方法已被用于产生各种类型的肿瘤类器官，如胰腺癌[23]、肾癌[24]、卵巢癌[25]、乳腺癌[26]等，这些类器官已被应用于肿瘤基础研究、药物研发和耐药性研究等各个方面。然而，传统的培养方法有一些缺点，包括反映肿瘤生长过程中微环境特点的不足、生成类器官结构的随机性、批次间较大的差异性和较差的可重复性等[3,6]。

传统培养通常利用EHS小鼠肉瘤中提取到的天然ECM,包含各种必需的ECM成分和可溶性生长因子，可模拟基底膜结构并有助于类器官培养过程中细胞的增殖和分化[27]。但由于传统ECM来源于小鼠肉瘤组织，与人肿瘤生长环境有一定差异，且所含成分复杂可变，制备成本较高，降低了可重复性[6]。传统肿瘤类器官培养依赖于人工操作，由于肿瘤的异质性与手工误差，可重复性较低[28,29]。且人工培养一般需要4～6周才能获得足够数量的类器官，用于药物筛选的时间过长，效率低下，由于临床治疗决定通常是在诊断后14天内作出，现有的肿瘤类器官生成时间将导致治疗延误[30]。肿瘤类器官形态特点、数量和大小的动态变化可为肿瘤发生发展机制和药物治疗提供线索[31],但在相差显微镜下很难清晰观察3D结构，尤其对于高通量的图像数据集，这些指标获得更加困难，需要耗费大量的人力[32]。

3、新型肿瘤类器官生物工程技术

随着生物工程学和合成生物化学等交叉学科的不断发展，越来越多工程学技术被应用于优化肿瘤类器官的培养。传统培养技术下产生的肿瘤类器官结构相对简单，反映原肿瘤组织结构和微环境的能力相对有限[3],且观察和评估技术模糊，将新型工程学技术，如生物合成材料、微流控、3D打印以及基于机器学习的人工智能图像评估等运用于肿瘤类器官培养可获得更可控的结构组织，培养出更接近于原始肿瘤组织的肿瘤类器官。

3.1生物合成材料

TME在肿瘤的发生发展和转移过程中起着关键作用，目前的研究逐渐明确了其中的重要细胞类型(如基质细胞和免疫细胞)和其他成分(如血管、淋巴管和ECM成分)对肿瘤发生发展和治疗反应的作用。新型生物合成的ECM材料具有可调节的生物物理和化学特性[33],并可以添加特定的TME细胞成分与肿瘤细胞共培养，以更好地模拟TME的物理和生化特性。ECM生物材料可以分为水凝胶和非水凝胶基质。

水凝胶ECM可以分为天然水凝胶(包括海藻酸盐凝胶和透明质酸凝胶等)和合成水凝胶(主要是聚乙二醇水凝胶),这些聚合物均具有生物相容性，且无细胞毒性。

天然水凝胶具有高生物相容性、低免疫原性且低成本，但具有生物惰性，本身难以支持细胞生长分化成类器官，通常需要通过化学修饰或在其中填充胶原蛋白等支持类器官生长[34]。海藻酸盐来源于褐藻，自CAPELING等人研究发现海藻酸盐与间充质细胞共培养的体系下可以支持小肠类器官的生长后[35],CARIGGA等人制备出海藻酸盐-明胶水凝胶来培养胰腺癌类器官，该水凝胶与最先进的成像检测设备兼容，可以进一步利用培养出的肿瘤类器官通过高通量成像分析提供关于光敏剂和光动力治疗效果的可靠数据[36]。透明质酸是更为常用的天然水凝胶，来源于脊柱动物的结缔组织[37],最先从牛眼玻璃体中分离获得。LIANG等人利用明胶和透明质酸作为支架来生成胶质母细胞瘤类器官并在转录组水平进行评估，证明培养的类器官保留了患者来源肿瘤的关键神经发育标志物和基因表达谱[38]。NG等人利用酶交联的明胶和透明质酸水凝胶，通过苯酚基团修饰，培养结直肠癌类器官，可以很好地控制水凝胶的机械强度和凝胶化速率[39]。鉴于TME中所包含的各种非上皮细胞类型(包括免疫细胞和基质细胞),尤其是免疫细胞也极大地影响着肿瘤治疗反应[40]。体外对这种肿瘤微环境进行建模在过去一直是一个重大挑战，FORSYTHE等人将手术切除的肉瘤组织消化后在透明质酸和胶原合成的水凝胶中培养出肉瘤类器官用于化疗药物筛选，并将患者匹配的免疫细胞与肿瘤细胞在该基质环境中共培养用于筛选免疫治疗有效的药物[41]。

合成水凝胶也被广泛探索作为肿瘤类器官培养基质，聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是制备合成水凝胶最常用的材料之一，可通过光聚合反应、Michael交联反应或活化的谷氨酰胺转氨酶酶促反应生成，聚合水凝胶无毒并允许细胞在其中生长和分化[3]。BOCK等人利用EDC/NHS L-半胱氨酸偶联的鱼明胶(Gel-SH)与4臂PEG-马来酰亚胺(PEG-4MAL)通过Michael交联反应形成合成水凝胶培养乳腺癌细胞，该水凝胶可提供合适的基质硬度1 kPa,并能提供多种特异性黏附肽，成功支持HR(+,-)/HER2(+,-)原代癌细胞和类器官生长超过2～3周，培养出的类器官体积更大、代谢活性较高，对阿霉素、EP31670和紫杉醇治疗均有反应[42]。

除水凝胶ECM,目前还开发了各种非水凝胶支架，即利用各种合成可降解聚合物如PLLA、PLGA、PCL等作为多孔支架构建肿瘤类器官，不仅有助于营养物质、氧气和废物的交换，还可以更好地控制类器官生长结构。由于支架结构类似于骨骼中的骨小梁结构，很多骨肿瘤或其他肿瘤骨转移瘤的类器官培养通常用到该基质[43]。CONTESSI等人通过3D打印的聚氨酯(PU)支架开发了一种仿生的骨肉瘤体外模型，并填充人基质细胞(hMSC)以提供ECM,通过测试不同几何形状的支架最终找到了形态和物理性能最佳的支架，并填充hMSC合成的生物分子以更好地模拟肿瘤生长过程中微环境的影响。将支架去除活细胞后接种SAOS-2骨肉瘤细胞证明了该支架作为体外骨肉瘤模型的潜在用途[44]。

3.2微流控技术

精细制造技术和3D打印技术的进步为肿瘤类器官高通量培养提供了更多工具[45]。尽管生物材料在支持类器官的生长方面取得了较大进展，但生成类器官的形状和大小仍有较大差异，这种批次间差异性在生物医学应用(如药物筛选)时有一定负面影响[46]。微流控技术通常是将一群细胞高密度种植于一个微孔内培养类器官，这些细胞在统计学上可以代表亲代肿瘤组织的异质性细胞群[30],并在确定的Matrigel体积中成型，可以更好地反映患者肿瘤的异质性，能同时实现类器官间的同质性和患者间的异质性。同时，还可利用计算机设定时间点精准加入各种生长因子更好地调控类器官的生长，且可减少培养过程中的污染，极大缩短疾病模型建立时间，降低人工成本，快速便捷地产生形状、尺寸和成分一致的类器官，利于高通量类器官培养和药物筛选[47]。

JIANG等人开发了一个自动化微流控类器官培养平台，包含类器官产生的微流体模块(M1)和自动分配类器官样品的3D液滴输出模块(M2)。M1模块处于低温环境下，通过一个37℃下的三通管使包含细胞群的Matrigel液滴凝胶化。M2是高时空分辨的液滴输出器，使单个类器官前体依次进入96孔板。微流控系统中每个小液滴中包含的细胞数目通常较多，本文每毫升包含2.0×107个细胞，高细胞密度下可迅速发育成类器官，5～7天即可构建出类器官的结构。传统培养技术下通常需要4～6周才能使类器官生长达到可用于药物筛选的尺寸(直径大于400 mm),微流控技术下只需1周。通过组织学和测序确定患者来源的类器官与亲本肿瘤组织的基因组和转录组一致，并通过药物测试确定培养出的类器官可反映患者对抗癌药物的特异性反应。 目前在96孔板上培养出类器官的成功率较高，可达95%以上，且在评价个体化化疗的准确率也可达到81%[30]。此外，液滴微流控平台还被用于在藻酸盐微滴内高通量生成乳腺肿瘤类器官等[34],有着广泛的研究及应用前景。

3.3深度学习网络

肿瘤类器官形态大小的动态变化对于研究肿瘤生长形态和药物治疗反应至关重要，但由于类器官是一个3D结构，在高通量图像数据集中这些指标很难获得，并且需要耗费大量的人力。随着深度学习网络在图像识别方面研究的深入，利用深度学习识别类器官的这些指标也成为一个有前景的发展方向，先后创建出多个深度学习平台用于追踪和分析单个类器官的生长情况。MATTHEWS等人提出了类器官图像分析平台OrganoID可以自动识别、标记和跟踪在明场和相差显微镜下的单个类器官，与人工计数准确率(95%)和大小测量准确率(97%)具有高度一致性，在为期4天的延时显微成像中单个类器官的跟踪精度也可以保持在89 %以上，实现了直观、详细、准确的类器官图像分析[32]。ABDUL等人提出了D-CryptO用于结肠类器官的形态分析，可识别类器官传代和短时毛喉素刺激过程中的形态变化，且可分析化疗药物处理后类器官的细微变化，证明了该平台可用于检测药物处理类器官形态变化的潜力[48]。

4、挑战与展望

近年来，通过多学科研究方法的交叉，类器官技术取得了极大进展，目前已经可以部分实现通过控制物理和生化信号更好地促进肿瘤类器官生长和保真度，工程学技术也越来越多地被应用，以控制生成高通量、高保真度、高重复性的类器官。其中，肿瘤类器官培养过程中基质成分对于类器官的生长至关重要，传统方法使用的鼠尾胶已不再是最优解，逐渐开始探索通过工程学方法合成与开发新材料以辅助类器官培养。目前使用材料的局限性在于很难理解每种材料的哪些特性影响着细胞的特定行为，难以根据目的精准定制ECM[27]。为了解决这一问题，可以与人工智能或物理力学技术相结合，如最近基于人工智能计算建模分析寻找材料动力学与干细胞自组织行为之间的相关性[49]。这些技术的发展已应用于正常类器官的培养，之后必将也可用于肿瘤类器官的优化培养，以通过寻找肿瘤微环境中各种生化和物理特征更好地模拟肿瘤类器官生长环境。同时，还可以开发包含血管、免疫细胞等成分的类器官培养环境，以更好地模拟肿瘤生长环境[50]。微流控装置可高通量培养肿瘤类器官，缩小类器官大小和基因表达水平批次间的差异，提高类器官的质量控制，但液滴基质的成分仍有待进一步研究[29]。人工智能深度学习是分析大数据集和识别变量间关系的有力工具，不仅可用于ECM建模分析，还可与高通量测序技术相结合评估肿瘤类器官与患者来源肿瘤组织的一致性和分析类器官形态大小变化的图像信息，目前这一领域研究仍需进一步探索。此外，尽管目前已经成功建立了多种类型的肿瘤类器官，但一些罕见肿瘤类器官模型仍有待建立[51]。不同类型肿瘤及不同个体肿瘤均具有很强的异质性，需要不同培养条件，故可进一步优化培养基，缩短类器官成功生成的时间。随着开发合成生物材料、微加工辅助和深度学习网络用于类器官培养，肿瘤类器官可进一步用于肿瘤发生及药物耐药机制研究和药物筛选，有助于实现精准的个体化医疗目标。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(编号:81972572);

文章来源:李梦凡,余茜颖,姜伟.肿瘤类器官工程学技术的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(17):3300-3304.