自然杀伤(nature killer, NK)细胞属于天然淋巴样细胞家族，在人类中通常被定义为CD3-CD56+细胞，占循环淋巴细胞的5%～15%。NK细胞无需预先致敏就能杀死威胁宿主的癌细胞、异体细胞和外来病原体感染的细胞，被认为是癌症免疫监测、移植排斥和早期病毒免疫的关键效应细胞。但是在许多进展期癌症患者体内发现NK细胞功能被损害，致使肿瘤细胞能够逃避NK细胞的免疫监视。本文主要对NK细胞的免疫检查点及其抑制剂的研究进展作一综述，为恢复癌症患者NK细胞功能提供参考。

1、NK细胞杀伤识别和免疫检查点

NK细胞的天然杀伤能力依赖于激活性受体和抑制性受体维持的动态平衡和下游信号通路(图1)。NK细胞的激活受到主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)I类特异性抑制性受体信号的严格调控。健康细胞表达的MHC-I类分子与NK细胞上的抑制受体结合避免其遭受攻击。转化或病毒感染的细胞表面缺乏MHC-I类分子或高表达“应激配体”,会被激活的NK细胞识别并裂解，称为“missing self”模式。免疫检查点是免疫系统的重要调节器，通过控制免疫反应的类型、强度和周期来维持免疫稳态，提供自我耐受。这些蛋白质作为负调节因子在肿瘤上表达，并促进癌细胞的生长[1]。

图1 人类主要NK细胞激活/抑制性受体及配体   

2、NK细胞抑制基序

近年来新的NK细胞免疫检查点不断被探索，我们发现几种受体如PD-1、NKG2A/CD94、ILT2等，在胞浆尾部携带1～3个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM)。ITIM序列(I/VXYXXL/V)能招募酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2来执行功能[2],称为基于ITIM的抑制。TIM-3和LAG-3等虽然在其胞质尾部缺少ITIM序列，但其具有特殊的细胞内酪氨酸基序与抑制过程有关，称为缺乏ITIM的抑制性受体。上述免疫检查点的异常表达导致NK细胞功能失调，使用单克隆抗体药物或抑制剂阻断，有望改善NK细胞的抗肿瘤免疫功能。

2.1 基于ITIM的抑制

2.1.1 PD-1在癌症中的抑制与免疫治疗

程序性细胞死亡-1(programmed cell death-1,PD-1)表达于T细胞、NK细胞和其他天然淋巴样细胞。PD-1胞浆尾部携带一个ITIM序列。PD-1与PD-L1和PD-L2结合，介导包括NK细胞在内的免疫细胞失活。PD-L1(B7-H1)主要由许多体细胞在接触促炎细胞因子时表达；PD-L2(B7-DC)具有更有限的抗原提呈表达。PD-1能够维持外周免疫耐受，然而大多数癌细胞上调其表达以逃避免疫监视。例如肺腺癌和口腔鳞状细胞癌组织中NK细胞PD-1表达上调[3,4]。

作为免疫检查点，PD-1在阻断肿瘤发展的临床前研究及临床试验中显示巨大的应用潜力。PD-L1介导了头颈部癌患者中活化的PD-1+NK细胞功能障碍[5]。霍奇金淋巴瘤中CD56dimPD+NK细胞与髓系细胞表达的PD-L1结合，在体外可被抗PD-1拮抗剂逆转[6]。一项评估抗 PD-1单克隆抗体(Pembrolizumab)在不可切除的 III 期或 IV 期黑色素瘤患者 NK 细胞的功能和耗竭方面疗效的II 期临床试验(NCT03241927)正在进行中(表1,详情访问www.clinicaltrials.gov)。Pembrolizumab还参与与IL-12治疗转移性实体瘤或与同体异种NK细胞治疗胆道癌的I或II期临床试验(NCT03030378、NCT03937895)。另外，PD-L1单克隆抗体(Durvalumab)也被单独使用或联合其他抑制剂用于治疗头颈癌的I或II期临床试验(NCT03019003)。PD-L1/PD-1抑制剂可解除PD1+NK细胞的肿瘤免疫抑制功能，但PD-L1和PD-1的上游调控机制在很大程度上仍不清楚以及大多数患者不能从抗PD-1/PD-L1治疗中获益，对不同肿瘤类型、不同治疗途径、不同药物组合和不同治疗方案产生满意的疗效还有待探索。

2.1.2 NKG2A/CD94在癌症中的抑制与免疫治疗

自然杀伤细胞家族2成员A(NK group 2 family of receptor A,NKG2A)也称为CD159,表达于NK细胞和T细胞表面。NKG2A为NKG2家族中抑制性受体，与CD94结合形成异源二聚体发挥作用，识别人白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-E为配体[7]。与HLA-E连接后，NKG2A通过携带的2个ITIM序列传递抑制信号，抑制NK细胞分泌因子和细胞毒作用[8]。

NKG2A+NK细胞在肿瘤微环境中占主导地位。例如，非小细胞肺癌组织中NK细胞NKG2A的表达高于外周血中NK细胞[9]。肿瘤细胞也会上调HLA-E表达介导NK细胞杀伤逃逸。恶性细胞上HLA-E表达水平也与患者的总生存期相关。BEN等[10]研究显示HLA-E低表达的子宫内膜癌患者具有更长的总生存期。因此，使用抗体阻断NKG2A/CD94受体可以作为一种治疗策略。体外和体内研究表明，人源化抗NKG2A抗体(IPH2201,Monalizumab)用于血液恶性肿瘤是安全有效的[11]。Monalizumab也用于治疗妇科癌症(NCT02459301)的I期试验中，被认为是安全、耐受和有效的(表1)。此外，Monalizumab还联合西妥昔单抗治疗复发和/或转移性头颈部鳞状细胞癌患者(NCT02643550),联合Durvalumab治疗复发或转移性结直肠癌患者的II期临床试验(NCT02671435)也刚刚完成。尽管 NKG2A 阻断在癌症中具有广阔的临床前景，但关于 NKG2A 介导的癌症NK细胞功能障碍的潜在细节仍然未知。

2.1.3 ILT2在癌症中的抑制与免疫治疗

白细胞免疫球蛋白样受体(leukocyte immunoglobin-like receptor, LIR)或免疫球蛋白样转录本(immunoglobin-like transcript, ILT)不同程度表达于NK细胞、T细胞。LIRB1(ILT2)属于白细胞Ig样受体B亚家族中的I型跨膜糖蛋白，携带ITIM序列。ILT2以μmol/L的亲和力结合不同HLA-I类分子，识别HLA-G为其主要配体导致免疫耐受[12]。

ILT2与HLA-G结合可以抑制NK、T细胞免疫功能，代表免疫治疗的靶点。肿瘤细胞表达的HLA-G与Vγ9Vδ2T细胞上的ILT2结合抑制该细胞的细胞毒作用。HLA-G与ILT2的相互作用可促进髓系抑制细胞增殖，从而抑制T细胞和NK细胞的免疫活性和细胞毒作用。在腺癌中，ILT2的表达与恶性肿瘤的晚期病理分期呈正相关[13]。除了某些亚型的腺癌外，ILT2也被认为是胃癌的诊断和预后指标[14]。然而，SUN等[15]研究表明高水平可溶性HLA-G与获得性再生障碍性贫血中的ILT2相互作用抑制骨髓B细胞增殖，并且可被抗HLA-G和抗ILT2单克隆抗体阻断。由于B细胞表达ILT2,血浆中的HLA-G与其结合可抑制恶性B细胞的增殖，提示HLA-G与ILT2结合具有双重作用。需进一步研究ILT2在实体肿瘤和血液系统肿瘤中的作用。

表1 目前基于 NK 细胞检查点受体或分子的临床试验

2.1.4 TIGIT和CD96在癌症中的抑制与免疫治疗

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif domains, TIGIT)又称WUCAM或Vstm3,作为一种免疫抑制性受体存在于NK细胞及T细胞中。TIGIT由细胞外IGV结构域、1型跨膜区和含有ITIM序列和免疫球蛋白尾部酪氨酸(immuno-globulin tail tyrosine, ITT)样基序的细胞质尾部组成。ITIM或ITT基序中酪氨酸残基的磷酸化足以进行信号转导，当两个残基都发生突变时，TIGIT的抑制活性才会丧失[16]。CD96也是免疫球蛋白超家族的一员，表达于人类T细胞、NK细胞和B细胞上。CD96的胞外结构域相对复杂，包括三个由保守的半胱氨酸连接的免疫球蛋白样结构域，以及一个富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的膜近端茎结构域。

TIGIT与CD96为共抑制受体，已被证明是NK细胞活性的重要抑制靶点。TIGIT、CD96和CD226都能识别CD155作为其配体，但是各自亲和力显著不同，TIGIT对CD155的亲和力高于CD226[17]。CD226(DNAM-1)为NK细胞上的激活受体，TIGIT与其竞争结合CD155,从而减弱刺激信号，最终触发细胞外抑制信号。该抑制信号可被抗TIGIT抗体阻断进行逆转[18]。

肿瘤浸润性NK细胞上TIGIT的表达与肿瘤进展有关，并与多种癌症模型中NK细胞功能衰竭有关。在大肠癌[19]、卵巢癌[20]和肝癌[21]中，肿瘤内NK细胞上TIGIT和CD226表达失衡，影响肿瘤内NK细胞的功能。阻断TIGIT可增加循环NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性，提示靶向TIGIT可能是改善肝细胞癌患者NK细胞功能的有益途径[21]。DIXON等[22]报道在MC38结肠癌模型中，TIGIT和PD-1的双重阻断产生协同抗肿瘤作用，最终肿瘤完全消退。TIGIT阻断增强了NK、CD8+T细胞抗肿瘤效应，并降低了调节性 T 细胞的抑制能力，而TIGIT 阻断剂是否可以增强 T 辅助细胞反应仍是未知的。目前，使用抗TIGIT单抗或联合使用抗PD-1/PD-L1单抗的I期和II期临床试验正在进行中，以评估其对转移性或局部晚期实体肿瘤患者的安全性和有效性，如肾癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和结直肠癌(表1)。

CD96分子可能在免疫过程中扮演着相互矛盾的角色。SUN等[21]发现CD96在肝癌瘤内NK细胞中表达上调，且瘤内NK细胞产生的干扰素γ显著减少。使用CD96-/-小鼠的研究也表明CD96抑制NK细胞的功能[23]。相反，有研究报道CD96+或CD226+NK细胞频率与胰腺癌淋巴结转移呈负相关[24]。人CD96作为激活或抑制受体发挥作用可能取决于细胞类型和环境条件。但是阻断CD96可以抑制不同小鼠模型中的肿瘤转移[25]。抗CD96抗体与抗CTLA-4或抗PD-1抗体联合使用可有效抑制肺转移，增加局部NK细胞干扰素-γ的产生和浸润。

2.1.5 Siglec-7/9在癌症中的抑制与免疫治疗

唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins, Siglecs)是属于I型凝集素家族的免疫调节唾液酸结合受体。除Siglec-4外，其余成员均在免疫系统的各种细胞上有表达。大多数Siglecs的胞质结构域包含ITIM序列结构，从而调节细胞的先天和获得性免疫反应。抑制性受体Siglec-7和Siglec-9表达于NK细胞。

癌细胞表达高水平的唾液酸配体与NK细胞上的Siglec-7/9受体结合，并减弱NK细胞介导的细胞毒性[26]。Sigec-7和-9的含唾液酸配体广泛表达于不同组织学来源的肿瘤细胞上。在原发性慢性淋巴细胞 白血病和急性髓系白血病细胞上 也观察到Siglec-7和Siglec-9的配体[27]。JANDUS等[28]使用神经氨酸酶去唾液酸化K562(白血病)和HeLa(宫颈癌)细胞系可显著增加健康供者外周血NK细胞介导的细胞毒作用。此外，封闭NK细胞表面的Siglec-7可能使其介导的抑制解除，增强肿瘤清除。STANCZAK等[29]发现表达Siglec-9的T细胞也共表达其他检查点，暗示协同抑制的可能性。这些证据表明抗Siglec-7和抗Siglec-9阻断抗体可用于癌症免疫治疗，也可能与其他免疫检查点抑制剂联合使用。目前，仍缺乏对Siglec生物学的深入了解，需要完整记录 Siglec 配体及其在癌细胞上的表达，以增加我们对抑制途径的理解并帮助推进可行治疗方法的开发。

2.1.6 KIR在癌症中的抑制与免疫治疗

杀伤性免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptor, KIR)表达于NK细胞、NKT细胞和T细胞亚群。KIR家族(又称CD158)包含抑制性和激活性KIR,每个KIR识别一种特定的HLA-I类分子作为配体。当抑制性KIR与HLA-I类分子结合时，ITIM序列被磷酸化，为招募SHP-1和SHP-2蛋白酪氨酸磷酸酶创建了特定的对接位点。由于HLA-I类基因高度变异性，而KIR基因也以多种等位基因形式存在，使得KIR能够识别HLA-I类分子的微小变化[30]。目前关于人类、灵长类和其他哺乳动物KIR基因多态性的起源存在着强有力的讨论，但基因多态性对KIR和HLA介导的相互作用的影响却很有限。

KIR对NK细胞抗肿瘤反应的临床影响最初是在接受单倍体造血干细胞移植的急性髓系白血病患者中证实的[31]。SOLTANI等[32]在对KIR基因多态性与1型糖尿病风险之间的分析中显示KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL5可能是1型糖尿病风险的潜在易感因素。在肿瘤恶性过程中，抑制性KIR在各种癌症中上调，例如淋巴瘤、白血病、乳腺癌、非小细胞肺癌、皮肤癌和胆管癌[33]。此外，KIR-HLA相互作用还在生殖、感染和自身免疫性疾病产生作用。一些抗KIR的单抗，例如针对KIR2DL1-3的单抗，已用于治疗白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和一些实体瘤(表1)。人源化的IgG4单抗(IPH2101、1-7F9)已用于治疗多发性骨髓瘤和急性髓系白血病患者的I/II期临床试验，并显示出良好的安全性和有效性(NCT00552396、NCT00999830、NCT01222286)。

2.2 缺乏ITIM序列的抑制性受体

T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM-3)识别磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原细胞黏附分子1、高迁移率族蛋白B1蛋白和β-半乳糖苷结合蛋白作为配体。TIM-3胞质尾部没有ITIM序列，而是含有五个保守酪氨酸残基，对信号转导起重要作用。

TIM-3在成熟的静息CD56dimNK细胞上有表达，并在细胞因子刺激下进一步上调。事实上，TIM-3在自身免疫反应中通常表达很低，有助于保护性免疫。然而，TIM-3在肺癌、胃癌、晚期黑色素瘤等不同类型实体瘤患者外周血NK细胞上高表达，与NK细胞功能障碍和衰竭有关[34,35,36]。在胃癌、结肠癌和宫颈癌中，TIM-3的表达与晚期肿瘤淋巴结转移有关[37]。研究发现TIM-3基因敲除或抗体阻断有助于原位肝肿瘤荷瘤小鼠的肿瘤生长减缓、总生存时间延长[38]。此外，TIM-3与PD-1在CD8+T细胞上共表达，TIM-3+PD-1+T细胞似乎功能失调，表达的效应细胞因子的量显著降低[39]。TIM-3还与各种免疫细胞相互作用发挥抗肿瘤功能，但TIM-3对先天免疫细胞的调控作用复杂，该调控机制有必要进一步完善。目前，体内TIM-3联合PD-1的阻断，已经在各种临床前癌症模型和临床试验中证明T、NK细胞效应功能的恢复和肿瘤生长的显著减少(表1)。在此背景下， I 或II期临床试验正在评估单独或与抗 PD-1 mAb 联合使用的抗 TIM-3 mAb(即Sym023、TSR-022、LY332I367、MBG453)用于治疗不同实体瘤的安全性。

3、结语与展望

目前，仍有很多新的免疫检查点被不断发现并被尝试用于癌症免疫治疗。但不同免疫检查点抑制剂在不同癌症类型和不同个体之间存在较大的差异。可能是由于不同癌种和不同个体的肿瘤异质性所致，因此，联合用药可能更有价值。此外，有研究发现了其他的免疫疗法，如使用NK细胞激活受体激动剂或特定细胞因子以及可以调节肿瘤微环境的分子。另一方面，NK细胞在实体肿瘤中浸润困难、体内持久时间短以及微环境中存在大量抑制因素，故需要更多的研究来破解攻克的方案。简而言之，免疫检查点疗法获得了前所未有的临床成功，但仍需要深入研究其功能及分子机制，并探寻与其他检查点联合使用的最佳组合。

基金资助:成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划(编号:YYZX2021018);

文章来源:米锦涛,袁成良.NK细胞相关免疫检查点及其抑制剂的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4645-4650.