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LILRB1和LILRB4在急性髓系白血病诊断中的意义

2023-11-14 224 上传者：管理员

摘要：目的:探讨LILRB1和LILRB4在单核细胞分化急性髓系白血病(M-AML)诊断中的意义。方法:通过直接荧光标记流式细胞术检测109例急性白血病患者白血病细胞LILRB1、LILRB4、CD64和CD14的表达。结果:LILRB1在M-AML、NM-AML和ALL患者中表达阳性率分别为81.6%(31/38)、0(0/49)、27.3%(6/22),差异有统计学意义(P<0.01),其中M-AML组的阳性率明显高于NM-AML组和ALL组，ALL组阳性率明显高于NM-AML组；LILRB4在M-AML组中的表达阳性率为81.6%(31/38),在NM-AML和ALL组中均不表达(0/49,0/22),差异有统计学意义(P<0.01);单独检测LILRB1、LILRB4诊断M-AML敏感性均为81.6%,联合检测的敏感性为86.8%,特异性均为100%,优于CD64 (86.8%,61.2%)、CD14(31.6%,100%)。结论:LILRB1、LILRB4单独检测或联合检测对检出M-AML均具有极高的灵敏度和特异度，可作为诊断M-AML的新指标。

关键词：
LILRB1
LILRB4
单核细胞分化
急性髓系白血病
流式细胞术
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急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人最常见的白血病类型之一[1]。尽管我们对急性髓细胞白血病的生物学认识有了很大的进步，但急性髓细胞白血病患者的5年存活率只有20%～40%。AML的异质性从广泛的临床表现、表型特征、分子和细胞遗传学改变以及治疗反应中都可以明显看出[2]。在临床实践中，AML亚型的准确诊断对于风险分层和治疗计划至关重要。具有单核细胞分化的AML(M-AML),包括急性粒-单核细胞白血病(FAb-M4)、急性原始单核细胞白血病(FAb-M5a)和急性幼稚单核细胞白血病(FAb-M5b)[3]。M-AML具有与其他AML不同的临床特征，如白细胞计数高、凝血功能异常，发生髓外浸润的风险高[4]。一直以来，M-AML的诊断因缺乏高度敏感和特异的单核细胞标志物而受到限制。国外学者[5,6]发现LILRB1(也称为ILT2或CD85j)和LILRB4(也称为ILT3或CD85k)是未成熟单核细胞和成熟单核细胞高度敏感和特异的单核细胞标志物，可以可靠地区分M-AML和NM-AML,国内未见相关报道。本研究采用CD45/SSC双参数设门检测了109例急性白血病患者LILRB1和LILRB4的表达情况，现报道如下。

1、资料与方法

1.1 研究对象

2021年03月至2022年06月在本院血液科收治的109例急性白血病患者，M-AML 38例，NM-AML 49例，ALL 22例；10例良性血液疾病骨髓和正常人外周血作为对照组。急性白血病的诊断标准均符合《血液病诊断及疗效标准》。

1.2 标本

化疗前用肝素(或EDTA)抗凝管采集病人骨髓或外周血2 mL。

1.3 仪器和试剂

流式细胞仪使用BD公司FACS AriaII。单克隆荧光抗体为：CD45-PreCP(HI30)、LILRB1-PE(GHI/75)、LILRB4-APC(ZM3.8)、CD14-FITC(MφP9)、CD64-PE(10.1);溶血素和鞘液。所有的试剂均购自BD公司。

1.4 实验方法

在流式管中加入肝素(或EDTA)抗凝骨髓或外周血(调整细胞浓度为10×109/L)50 μL,按抗体滴定最适量加入相应抗体，混匀后室温避光孵育15 min。加入1 mL溶血素工作液，混匀后室温放置5 min, 500×g离心5 min后去上清。再加入1 mL鞘液离心洗涤，最后加入200 μL鞘液重悬上机检测。应用Diva软件获取30 000个细胞，CD45/SSC设门分析细胞表面LILRB1、LILRB4、CD14和CD64的表达，以内部阴性对照细胞(T淋巴细胞)设立阈值线，表面抗原的表达量≥20%判定为阳性[7]。

1.5 统计学分析

统计学分析采用SPSS 25.0软件完成，计数资料采用率表示，率的比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义；计量资料采用平均值±标准差表示，多组独立样本均数比较采用Kruskal-Wallis检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 急性白血病患者的临床特征对比分析

M-AML、NM-AML、ALL 3组患者比较，性别、白细胞计数、骨髓原始细胞比例差异均无统计学意义(P>0.05);M-AML组的老年患者(年龄>60岁)比例明显高于NM-AML组和ALL组，NM-AML患者血红蛋白高值比例(>90 g/L)、血小板计数高值比例(>100×109/L)均低于ALL患者，有统计学差异(P<0.05),见表1。

2.2 LILRB1和LILRB4在对照组正常造血细胞中的表达

10例对照组骨髓和外周血的正常粒细胞均不表达LILRB1和LILRB4;正常淋巴细胞部分表达LILRB1,不表达LILRB4;正常单核细胞均表达LILRB1和LILRB4,见图1。

表1 急性白血病患者的临床特征对比分析n(%)

图1 对照组外周血和骨髓正常造血细胞中LILRB1(CD85j)和LILRB4(CD85k)的表达粒细胞(蓝色),淋巴细胞(绿色),单核细胞(紫色)。

2.3 LILRB1 和LILRB4在3组急性白血病细胞中的表达

LILRB1在M-AML、NM-AML和ALL 3组中表达阳性率分别为81.6%(31/38)、0(0/49)、27.3%(6/22),差异有统计学意义(χ2=64.071,P<0.01),其中M-AML组的阳性率明显高于NM-AML组和ALL组，ALL组阳性率明显高于NM-AML组；LILRB4在M-AML组中的表达阳性率为81.6%(31/38), 在NM-AML和ALL组中均不表达(0/49,0/22), 差异有统计学意义(χ2=103.551,P<0.01),见图2。

2.4 AML中LILRB1、LILRB4和CD64、CD14诊断M-AML的敏感性及特异性

如表2所示，在AML中LILRB1、LILRB4诊断M-AML的敏感性均为81.6%,略低于CD64(86.8%),远高于CD14(31.6%);LILRB1、LILRB4诊断M-AML特异性和CD14相同，均高达100%,远高于CD64的61.2%。联合检测LILRB1、LILRB4的敏感性及特异性为86.8%、100%。

图2 M-AML、NM-AML和ALL中LILRB1(CD85j)和LILRB4(CD85k)的表达白血病细胞(红色),粒细胞(蓝色),淋巴细胞(绿色)。

表2 LILRB1、LILRB4和CD64、CD14诊断M-AML的敏感性及特异性

2.5 M-AML中LILRB1、LILRB4表达与染色体核型的相关性

在获得染色体核型结果的64例AML中，M-AML的染色体异常检出率为51.9%(14/27),略低于NM-AML的异常检出率67.6%(25/37),差异无统计学意义(χ2=1.620,P>0.05)。M-AML患者异常染色体核型预后中等和不良比例为85.7%(12/14),明显高于NM-AML患者的45.8%(12/25),差异有统计学意义(χ2=5.393,P<0.05)。8例核型异常预后不良组M-AML病例中，3例涉及11q23(MLL基因),3例涉及5号和/或7号染色体，2例为复杂核型。M-AML中LILRB1(+)组异常核型检出率55.0%(11/20)与LILRB1(-)组42.9%(3/7) 比较差异无统计学意义 (χ2=0.306,P>0.05);LILRB4(+)组异常核型检出率50.0%(10/20)与LILRB4(-)组57.1%(4/7)比较差异无统计学意义(χ2=0.106,P>0.05)。

2.6 M-AML中LILRB1、LILRB4表达与预后的相关性

20例M-AML患者在确诊后进行了化疗，化疗2个疗程后，14例患者获得了完全缓解(complete remission, CR)。LILRB1(+)组CR率64.7%(11/17)与LILRB1(-)组100%(3/3)比较差异无统计学意义(χ2=1.153,P>0.05); LILRB4(+)组CR率68.8%(11/16) 与LILRB4(-)组75.0%(3/4)比较差异无统计学意义(χ2=0.060,P>0.05)。

3、讨论

M-AML是AML的一种亚型，虽然随着治疗手段的发展，治疗结果有了很大的改善，但是总体来说复发率、病死率仍然很大，预后较差[8,9]。如何对M-AML进行早期和准确的诊断具有十分重要的意义。大多数M-AML无重现性染色体异常和特异性分子标志物，因此目前M-AML的诊断仍然主要依赖于在常规的骨髓形态学、细胞化学染色结合免疫表型来综合诊断。但是，骨髓中原始和幼稚单核细胞往往难于与原始粒系细胞及微颗粒型早幼粒细胞区分开来[10],在某些情况下未成熟的单核细胞中α-萘丁酸酯酶(ANBE)反应性可能很弱或阴性[11]。总体而言，应用流式细胞术(FCM)检测免疫表型更适合于单核细胞的鉴定，因为它具有广泛的可用抗体，可以结合形态学检查来提高诊断准确率。目前常用的通过FCM区分单核细胞分化的抗原标志物主要有CD4、CD11b、CD14、CD36和CD64等[12,13]。虽然未成熟单核细胞不同程度地表达这些标志物，但单独或组合使用这些标志物并不能足够敏感或特异地识别未成熟单核细胞。因此有必要为未成熟单核细胞探索新的敏感和特异的标志物，以提高诊断的准确性。

对染色体19q13.4上的白细胞受体复合体进行的基因测序分析已经鉴定出一个蛋白质家族，称为白细胞免疫球蛋白样受体(LILR),也称为免疫球蛋白样转录本[14]。LILR亚家族B(LILRB)由从LILRB1到LILRB5的5个成员组成。这些受体含有胞浆免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIMs),可以传递负信号来抑制免疫细胞的激活[15,16]。LILRB1(也称为ILT2或CD85j)在正常单核细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达。LILRB4(也称为ILT3或CD85k)由树突状细胞、单核细胞、内皮细胞和破骨细胞表达，但不表达于淋巴细胞[17]。目前关于LILRB1和LILRB4表达与急性髓系白血病分型诊断的相关研究甚少。

本研究检测10例对照组骨髓和外周血细胞显示：LILRB1和LILRB4在正常粒细胞中均不表达，在正常单核细胞中均完全表达，而在正常淋巴细胞中LILRB1部分表达，LILRB4不表达，与文献报道一致。

LILRB1和LILRB4在ALL病人中的表达研究国内外均未见相关报道。在本研究中检测了22例ALL患者白血病细胞中LILRB1和LILRB4的表达，结果显示27.3%的ALL中也表达LILRB1,但是未见LILRB4阳性表达，均明显低于M-AML的阳性表达率(81.6%),差异有统计学意义。

DOBROWOLASKA等[6]研究证实LILRB4在18例M-AML的肿瘤性单核细胞中表达。美国CHURCHILL等[18]对8例对照骨髓(BM,5例)和外周血(PB,3例)、64例M-AML和57例NM-AML的骨髓，通过流式细胞免疫表型进行了评估，研究表明，LILRB1/LILRB4在髓系细胞上的共表达是未成熟单核细胞和成熟单核细胞高度敏感和特异的单核细胞标志物，可以可靠地区分M-AML和NM-AML,敏感性/特异性高达100%/100%,优于其它标志物。本组研究检测的38例M-AML和49例NM-AML结果显示，LILRB1和LILRB4在M-AML中的阳性率均为81.6%,而在NM-AML组均未见阳性表达，在诊断M-AML中同样显示了极高的敏感性(81.6%)和特异性(100%),但是敏感性略低于CHURCHILL的报道。原因可能是研究的病例不同，曾有研究表明不同地理位置AML患者的临床特征差异较大[19]。其次是判断阳性表达的阈值不同，CHURCHILL的研究采用的阈值是≥10%,而本研究采用的是国内外流式检测通用的膜表面抗原表达量≥20%判断为阳性。

CD14的表达对于单核细胞分化是非常特异的，但是敏感性低，在未成熟的单核细胞常常表现出微弱的或缺失的CD14表达，特别是在AML-M5a中[12]。大部分研究都表明，CD64不仅在成熟单核细胞表达，在幼稚单核细胞也有较强表达，敏感性较CD14高，但是在M1、M2、M3中也可见到较高比例的中等强度的表达，特异性不高[20]。本组研究结果显示，在诊断M-AML中，CD14的特异性高达100%,但是敏感性较低(31.6%),CD64的敏感性(86.8%)明显高于CD14,但是特异性(61.2%)低于CD14。相比之下，LILRB1、LILRB4的单独检测或联合检测诊断M-AML的敏感性/特异性高达81.6%/100%、86.8%/100%,优于CD64和CD14。

细胞遗传学异常与AML的预后密切相关。国外报道急性单核细胞白血病患者染色体核型异常检出率为48.8%～71.2%,约80%11q23异常的病例见于M5[21]。本组结果显示M-AML的染色体异常检出率为51.9%,大部分为预后不良核型，主要累及11q23,与国外研究结果一致。LILRB1(+)组和LILRB4(+)组的异常核型检出率分别为55.0%、50.0%,与阴性组比较差异无统计学意义，暂未发现LILRB1和LILRB4的表达与染色体核型有相关性。

LILRB1、LILRB4表达与预后相关性研究国内外均未见报道。本组研究结果显示LILRB1(+)组CR率64.7%、LILRB4(+) 组CR率68.8%虽然都低于阴性组(100%,75.0%),但是差异均无统计学意义(P>0.05)。这可能与本组的病例数少有关。LILRB1、LILRB4表达是否与预后相关，还需要更多的研究证明。

综上所述，我们认为LILRB1、LILRB4均是单核细胞分化较特异的表面抗原，单独检测或联合检测对诊断M-AML均具有极高的敏感性和特异性，有助于提高M-AML的检出率及与NM-AML亚型的鉴别诊断。

参考文献:

[4]吕国庆,张肖肖,吴隼,等.急性单核细胞白血病的临床特点及预后分析[J].现代肿瘤医学,2022,30(17):3199-3203.

[9]白峰岩,王学博,赵方,等.儿童急性髓系白血病(M4/M5亚型)系统治疗的临床效果及预后因素分析[J].实用癌症杂志,2022,37(1):154-156.

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基金资助:海南省自然科学基金资助项目(编号:821RC1113);海南省卫生健康行业科研项目(编号:21A200177);海南省临床医学中心建设项目资助[编号:琼卫医函[2022]341号];

文章来源:饶若,王述文,吴莉芳等.LILRB1和LILRB4在单核细胞分化急性髓系白血病诊断中的意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(24):4582-4586.