引言

目前，临床上肿瘤的治疗方式主要有化疗、放疗以及手术治疗，而化疗是最为普遍的治疗方式。用于临床的小分子化疗药物甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸类似物，通过抑制二氢叶酸还原酶，阻断嘧啶和嘌呤合成，导致肿瘤生长受损，从而诱导肿瘤细胞凋亡[1,2,3,4]。然而，由于甲氨蝶呤溶解度低、体内清除速度快、具有较强的毒副作用、到达肿瘤部位的有效药物量较低，因此疗效有限[5]。

纳米技术的发展为小分子药物的递送提供了新的解决办法，通过将小分子药物包封进纳米颗粒中以改善药物的溶解度以及药物的体内分布[6]。纳米颗粒负载甲氨蝶呤的研究已有较多的报道，主要有金属纳米颗粒[7]、脂质体[8]、聚合物纳米颗粒[9]等，这些纳米材料能够一定程度上改善甲氨蝶呤的毒副作用以及药物的递送。白蛋白纳米材料的免疫原性低、来源丰富，已成为合适的候选药物载体，具有广泛的应用前景[10]，目前已有白蛋白类药物白蛋白紫杉醇上市[11]。白蛋白类材料因具有与内源性蛋白相近的结构特点，使得其在药物递送方面具有独特的优势，例如具有较好的生物相容性和长循环特性[12,13]。然而，目前白蛋白的制备方法多使用有机溶剂或交联剂，合成反应也相对难以控制[14]。因此设计一种绿色、工艺简便的方法至关重要。此外，负载的药物需要从颗粒中释放出来，才能发挥抗肿瘤作用[15]。研究结果表明，肿瘤微环境中还原性分子(如谷胱甘肽)的表达水平较高[16]，其中细胞内部含量为2～10 mmol·L-1，约为细胞外部(2～20μmol·L-1)的1 000倍[17]。二硫键可被还原性分子谷胱甘肽切断，从而释放纳米颗粒中的药物，因此二硫键可作为控制药物释放的开关[18]。目前，利用二硫键交联的白蛋白纳米颗粒递送甲氨蝶呤用于肿瘤的治疗尚无研究。

基于以上特点，本研究通过小分子调控白蛋白纳米颗粒自组装，制备以二硫键为主的牛血清白蛋白纳米颗粒(BSA NP)。将MTX负载进BSA纳米颗粒中，通过粒径、形貌以及电位对颗粒进行表征，得到了尺寸分布均一、形貌规整、稳定的负载MTX牛血清白蛋白纳米颗粒(BSA-MTX)。通过紫外图谱验证了MTX可以成功负载进颗粒之中，进一步对BSA-MTX的形成机理进行研究，结果表明，BSA纳米颗粒内部形成了二硫键交联网络，具有还原响应特性。同时，载药颗粒在体外可以有效杀伤肿瘤细胞，高效诱导肿瘤细胞凋亡。此外，在负载药物后，纳米颗粒的肿瘤细胞内吞并不会产生明显的变化，确保了纳米药物可以进入细胞发挥肿瘤杀伤作用。该纳米颗粒还具备较好的生物相容性，基本不会产生溶血现象。BSA-MTX可以显著提升对荷瘤小鼠的抗肿瘤治疗效应，具备了较好的临床转化前景。

1、实验

1.1实验材料

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid,MES)、十二烷基硫酸钠(Lauryl sodium sulfate,SDS)、吐温(Tween)购于Sigma-Aldrich(圣路易斯，美国)。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)、异硫氰基荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)、二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海，中国)。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、胰酶细胞消化液(0.05%)、多聚甲醛(4%)购于上海碧云天生物技术有限公司(上海，中国)。磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、RPMI 1 640培养基、青霉素/链霉素购于赛默飞世尔科技(上海，中国)。

1.2实验仪器

紫外/可见光分光光度计(UV-via,Cry50)购于VARIAN;激光粒度仪-Zeta电位计(Nano-ZS 90,DLS)购于Malvern，酶标仪、离心机(D-37520)购于赛默飞世尔科技(上海，中国);场发射透射电子显微镜(Tecnai-12 Bio-Twin)购于FEI公司(荷兰);共聚焦激光扫描显微镜(Nikon A1R)购于日本;流式细胞仪(BD FACSVerse)购于FCM公司。

1.3 BSANP合成

将100 mg BSA溶于3 m L二次水中，加入2 mg DTT，在40℃的水浴中搅拌2～3 h，转速为300 r/min，从而制备还原的BSA母液。取出部分上述反应后的BSA溶液并稀释到5 mg/m L，取2 m L该稀释液并与2 m L MES(0.1μmol·L-1,p H=5.2)、60μL SDS(6%)和50μL(1%)H2O2混匀，65℃条件下水浴反应1～2 min，同时观察溶液的颜色变化，直至出现白色乳光，即代表纳米颗粒形成。此时终止反应，并用一次水透析24 h以除去溶液中的MES、SDS等小分子。透析结束后，收集溶液即为BSA NP。通过DLS测定粒径分布和Zeta电位值。

1.4 BSA-MTX合成

将1 mg MTX溶解在50μL DMSO中，取出部分1.3中还原的BSA母液，用二次水稀释到5 mg/m L。将MTX溶液缓慢滴加到BSA溶液中，混匀，再以与1.2中相同的步骤加入MES与SDS，以相同的条件反应，透析，即得到负载MTX的BSA纳米颗粒(BSA-MTX)，通过DLS测定粒径分布和Zeta电位值，用TEM观测形貌。

1.5紫外测定

用DMSO溶解MTX，依次制备浓度为0.937 5μg/m L、1.875μg/m L、3.75μg/m L、7.5μg/m L、15μg/m L、30μg/m L、60μg/m L的溶液，用紫外测定吸收波长。记录398 nm处的吸收峰值，绘制标准曲线。同时，分别测定制备的BSA-MTX、BSA NP溶液的紫外吸收曲线，以判定BSA纳米颗粒负载MTX的情况并计算负载量。

1.6还原响应实验

将BSA-MTX重悬在二次水中，加入5 mmol·L-1的DTT溶液，涡旋混匀。分别在混匀后第4 h和第8 h，用DLS测定BSA-MTX溶液的粒径变化。

1.7稳定性实验

将BSA-MTX用RPMI 1 640(10%FBS)重悬，涡旋混匀，分别在第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d用DLS测定粒径变化。

1.8细胞毒性

将预种植在培养瓶中的B16F10细胞用胰酶消化下来，通过离心机离心3 min(1 000 r/min)，去掉上清，用含有10%FBS的RPMI 1 640培养基重悬，计数，调整细胞密度。将稀释后的细胞种植在96孔板中，保持细胞密度为每孔104个，放置在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。去掉96孔板中的培养基，用PBS轻轻洗涤3遍，依次加入含有不同MTX浓度的BSA-MTX和MTX纯1 640培养基(MTX浓度依次为2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L)。放入培养箱中分别孵育不同的时间后，去掉孔板中上清，用PBS轻轻洗涤2～3次，根据MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒测定细胞存活率。

1.9细胞凋亡

使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。即将B16F10肿瘤细胞铺在24孔板中，每孔105个细胞，放入培养箱中孵育24 h。加入含有不同MTX浓度的BSA-MTX纯1640培养基(MTX浓度依次为2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L)，孵育4 h。收集上清液，用PBS轻轻洗涤细胞一次，再用胰酶消化细胞，用FBS终止消化。收集细胞悬液，加入到已收集的上清中，离心(1 000 g)5 min，弃去上清液，加入少量PBS重悬并计数。取5×104个细胞并加入195μL Annexin V-FITC结合液，轻轻重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀;再加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，混匀。室温避光孵育10 min，用流式细胞仪检测。

1.10细胞吞噬

将B16F10细胞铺在6孔板中，细胞密度为每孔1.5×105个，每孔中含有2 m L的1 640全培养基，放于37℃，含有5%CO2的培养箱中孵育24 h;去除培养基，用PBS洗涤细胞，再将含有FITC标记的BSA-MTX和BSA NP的新鲜培养基加入到孔板中，再放到培养箱中，进一步孵育4 h。去除皿中的培养液，并用PBS洗涤细胞3次;加入4%多聚甲醛固定细胞10～15 min，收集细胞并点到玻璃片上，加入300μL抗荧光淬灭封片剂，用激光共聚焦显微镜观察细胞吞噬情况。

1.11溶血实验

取新鲜小鼠血液，保存在含有1%肝素钠预处理的抗凝管中。离心收集细胞(3 000 r/min、10 min)，去掉上清，收集下层的红细胞，再用PBS洗涤细胞2～3次，得到纯净的红细胞悬液。向红细胞悬液中分别加入不同MTX浓度(1.56μg/m L、3.12μg/m L、6.25μg/m L、12.5μg/m L、25μg/m L)的BSA-MTX溶液，均匀混合后，在37℃条件下孵育2 h。其中PBS与1%的吐温分别作为阴性对照和阳性对照。待红细胞与材料孵育之后，将细胞悬液离心分离(3 000 r/min、10 min)，取离心后的上清100μL加入到96孔板中，在540nm波长处检测血红蛋白的吸收，测定溶血率。

1.12抗肿瘤治疗实验

通过皮下注射B16F10肿瘤细胞构建荷瘤小鼠模型(每只5×104个细胞)。待小鼠的肿瘤体积为100～200 mm3时(体积公式为V=LW2/2,L和W分别代表长度和宽度，单位为mm)，将小鼠随机分为3组，每组5只，尾静脉注射PBS、游离MTX和BSA-MTX(含等量的MTX,100μg/只)。每3 d治疗一次，连续治疗4次。到第14 d时，对治疗后的小鼠进行拍照，并将小鼠脱颈处死，取出肿瘤进行称重。

2、结果与讨论

2.1BSA NP与BSA-MTX合成

BSA NP以及BSA-MTX的合成过程如图1所示。如图2a所示，本实验成功合成了粒径均一的BSA NP，粒径尺寸约为71 nm,BSA NP溶液呈现出澄清透亮的乳白色。通过负载MTX可制得BSA-MTX，如图2b所示，制得的BSA-MTX粒径也较为均一，尺寸为78 nm，相较BSA NP尺寸略有增加。同时溶液的颜色也由乳白色变为淡黄色，表明MTX成功负载到BSA NP之中。通过TEM表征了BSA-MTX的形貌，由图2c所示，BSA-MTX具有较为规整的形貌。图2d中Zeta电位数值显示，BSA NP电位值接近-15 m V，而负载MTX之后降低为-20 m V左右。Zeta电位绝对值的增大，表明负载MTX后BSA-MTX的稳定性有了明显的提升。

图1 BSA NP和BSA-MTX合成示意图

图2(a)BSA NP与(b)BSA-MTX粒径分布图(插入图为溶液颜色图);(c)BSA-MTX的TEM图;(d)BSA NP与BSA-MTX电位值统计图

2.2紫外表征

为了进一步评估MTX是否成功负载到BSA NP上以及MTX的负载率，对样品进行了紫外光谱分析。图3a分别为不同浓度MTX的紫外吸收曲线，由图中可以看到MTX在300 nm和395 nm处具有紫外特征吸收峰，而BSA NP在280nm处有紫外特征吸收峰。为了使MTX的吸收峰值不被BSA的峰值干扰，故选用了MTX在395 nm处的紫外吸收峰进行研究。由图3a中可以看出，随着MTX浓度的增大，其紫外吸收值呈现递增趋势。根据图3a中395 nm处的紫外吸收值绘制标准曲线(如图3b所示)，MTX的标准曲线为y=0.015 7x+0.014 5(y代表吸收值，x代表浓度，单位为μg/m L),R2=0.999 8，表明具有较好的拟合度，可用于浓度的测定。

随后对BSA-MTX进行紫外表征发现，BSA-MTX在280nm处具有与BSA一致的紫外特征峰，在395 nm处具有与MTX一致的紫外特征峰(图3c)，以上结果进一步表明MTX成功负载到了BSA NP上。同时，根据在395 nm处的紫外吸收值，可计算出纳米颗粒中的MTX的负载率约为11%。

2.3还原响应性

本研究还验证了以二硫键交联为主的BSA-MTX在还原条件下的粒径变化情况。如图4a所示，在DTT刺激下，BSA-MTX的粒径在2 h内逐渐减小，并降至30 nm左右。随着刺激时间的延长，粒径进一步变小，在8 h时变为10 nm左右。以上实验结果表明，在DTT的刺激下，BSA-MTX发生了粒径的断裂，即DTT破坏了BSA-MTX内部的二硫键交联网络，使得颗粒发生解聚，从而粒径减小。因此，BSA-MTX具备还原响应性，使得纳米颗粒可以在肿瘤微环境中有效释放MTX，发挥肿瘤治疗作用。

图3(a)不同浓度MTX紫外吸收曲线;(b)MTX标准曲线;(c)BSA-MTX、BSA NP与MTX紫外表征图

图4(a)还原条件下刺激4 h和8 h后BSA-MTX尺寸分布图;(b)BSA-MTX在含有10%FBS的RPMI 1640中5 d内的粒径变化图

2.4稳定性试验

为了探究BSA-MTX的稳定性情况，将BSA-MTX重悬在全1 640培养基中，观测粒径变化。如图4b所示，在连续5 d的测定中，粒径并未发生显著的变化，表明BSA-MTX具有良好的储存稳定性。

2.5细胞毒性检测

选用B16F10肿瘤细胞作为模型细胞，进行细胞毒性测试。如图5所示，在孵育4 h时，BSA-MTX比MTX呈现出更强的肿瘤杀伤作用，特别是在浓度为5μg/m L和10μg/m L时，BSA-MTX作用下的细胞生存率约为MTX的一半。表明纳米化后，BSA-MTX可以高效内吞进入肿瘤细胞，因此与MTX相比具有更强的肿瘤杀伤作用。而在孵育6 h后，BSA-MTX对细胞的抑制作用比4 h时更强，表明了MTX对细胞的杀伤具有时间依赖性。以上结果均表明BSA-MTX具有较好的肿瘤杀伤作用。

图5 BSA-MTX与MTX在不同MTX浓度条件下(2.5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L和20μg/m L)分别与细胞作用4 h和6 h对细胞毒性影响

2.6细胞凋亡检测

以上毒性实验已验证了BSA-MTX具有较强的肿瘤杀伤作用。在此基础上，进一步探索BSA-MTX对细胞的凋亡作用。如图6所示，由低浓度到高浓度的MTX对肿瘤细胞的凋亡作用逐渐增加。即当孵育浓度依次为2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L时，凋亡的细胞比例依次为24.3%、48.4%、66.4%、74.2%。这一结果与2.5中细胞毒性的结果一致，也再次验证了BSA-MTX对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，可以高效诱导细胞凋亡。

2.7溶血实验

如图7a所示，吐温作为阳性对照组，处理红细胞后产生了显著的溶血作用，PBS作为阴性对照组，并未发生溶血现象。而低浓度(1.56μg/m L,3.12μg/m L,6.25μg/m L,12.5μg/m L)条件下，BSA-MTX并不会对红细胞产生溶血作用。即使处于较高浓度(25μg/m L)，与吐温处理过的红细胞相比，BSA-MTX处理后细胞的上清也并未看到明显的血红蛋白产生。通过定量实验发现，溶血率基本与图片观测的一致，MTX在1.56μg/m L,3.12μg/m L,6.25μg/m L,12.5μg/m L,25μg/m L时的溶血率接近0，而阳性对照组(吐温)的值为100%(图7b)。以上实验数据说明了BSA-MTX具有良好的生物相容性。

图6 BSA-MTX在不同浓度条件下(2.5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L和20μg/m L)与细胞作用4 h后对细胞的凋亡作用

图7(a)不同MTX浓度(1.56μg/m L,3.12μg/m L,6.25μg/m L,12.5μg/m L,25μg/m L)条件下BSA-MTX对小鼠红细胞的溶血影响。PBS与吐温分别作为阴性与阳性对照。(b)不同条件下溶血率统计图

2.8细胞内吞

如图8所示，BSA-MTX与BSA NP具有一致的内吞效果，表明负载MTX并不会改变BSA NP的内吞效率。同时，激光共聚焦图片也表明，构建的纳米颗粒具有较好的肿瘤细胞内吞行为，这对纳米颗粒进入细胞内，发挥杀伤肿瘤具有重要的意义。

2.9抗肿瘤治疗

本实验构建了B16F10荷瘤小鼠模型，以评估BSA-MTX的抗肿瘤治疗效应。构建模型、治疗以及处死小鼠、评估肿瘤质量的作用时间点如图9所示。

图8标记FITC的BSA-MTX与BSA NP与B16F10细胞孵育4 h后的激光共聚焦照片

图9 BSA-MTX的抗肿瘤治疗示意图

分别将PBS、游离的MTX、BSA-MTX通过尾静脉注射入B16F10荷瘤小鼠体内，进行抗肿瘤效果评价。如图10a所示，与对照组(PBS)相比，游离MTX治疗后的小鼠肿瘤略小。而BSA-MTX组的肿瘤生长抑制作用明显强于游离MTX组与PBS对照组，说明BSA-MTX组的治疗效果有所改善。由图10b得到的结论与以上相同，即BSA-MTX治疗后疗效要优于PBS组与游离MTX组。经BSA-MTX治疗后的小鼠肿瘤质量约为PBS对照组的1/3，约为游离MTX组的一半，这主要是因为BSA-MTX具备改善的体内循环以及被动靶向性，使得聚集到肿瘤的纳米颗粒更多，以进一步控制释放MTX，发挥抗肿瘤作用。

图1 0(a)荷瘤小鼠分别经PBS、MTX和BSA-MTX治疗后，在第14 d的照片;红色圆圈位置为肿瘤;(b)在第14 d处死小鼠后取出肿瘤称重的质量统计图

3、结论

(1)构建了以二硫键交联为主的白蛋白纳米颗粒，并将抗肿瘤药物甲氨蝶呤负载其中，从而制备出甲氨蝶呤白蛋白纳米颗粒(BSA-MTX)。该纳米颗粒具有较为均一的尺寸以及形貌，并且具有维持良好稳定性的电位值。紫外光谱显示出MTX可以负载到BSA NP之中，并且负载率达到11%。

(2)还原条件下，BSA-MTX发生断裂，尺寸逐渐减小，表明该颗粒形成了以二硫键为主的交联网络。除此之外，该纳米颗粒还具有较好的储存稳定性以及生物相容性，不会造成溶血现象。

(3)BSA-MTX对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用，可高效促进细胞凋亡。激光共聚焦显微镜观测结果表明BSA NP负载了MTX后仍然具有较好的内吞效果，对纳米颗粒进入细胞抑制肿瘤生长具有重要意义。

(4)BSA-MTX对荷瘤小鼠的肿瘤具有较好的抑制效果，显著提升了抗肿瘤治疗水平，具有较好的临床转化前景。

王怀基,董海青.还原响应的白蛋白纳米颗粒负载甲氨蝶呤用于抗肿瘤治疗[J].材料导报,2019,33(S2):547-552.

基金:国家自然科学基金面上项目(31771090)