肺癌是人类最常见的一种恶性肿瘤，而骨转移则是肺癌等恶性肿瘤第三大常见的转移现象[1]。据统计，大约有30%～40%的肺癌患者在疾病进展过程中会发生骨转移[2]。而骨转移所引起的骨相关事件(骨痛、骨折和高钙血症等)将严重影响患者的生存期与生活质量。因此，早期发现、诊断和干预肺癌骨转移对提高患者的生活质量和预后具有至关重要的意义。

目前临床上对于肺癌骨转移的诊断主要依赖于影像学方法，如放射性核素骨扫描(ECT)、X线检查、CT扫描和MRI等。令人担忧的是，约50%的肺癌患者在影像学检查明确诊断骨转移时，往往已经发生了骨相关事件[3]。本文将探讨肺癌骨转移形成的分子机制，以及与骨转移机制相关的血清学标志物，并探讨它们在临床应用中的价值。

1、肺癌骨转移形成的分子机制

肿瘤细胞在骨内的定植是一个循序渐进的过程，包括以下三个步骤：(1)在骨髓中形成预转移生态位(pre-metastatic niche, PMN),以利于循环肿瘤细胞的驻留；(2)肿瘤细胞从循环系统中逸出并定位到PMN;(3)肿瘤细胞一旦定植，PMN会逐渐演化为一个微转移巢，这有助于肿瘤细胞的生存，并最终形成肿瘤骨转移灶[4]。

骨转移的发生始于PMN的形成，以及肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离后进入循环[4]。骨转移是一个复杂的长期过程，包括肿瘤细胞在骨髓中的定植、休眠、再激活和增殖，最终形成转移病灶[5]。骨转移的发生与骨微环境细胞因子和骨代谢调节因子的变化密切相关，这些因子包括血清骨微环境细胞因子、血钙和血磷、钙磷代谢调节的激素变化，以及骨代谢平衡破坏导致的骨转换标志物的变化(图1)。

图1 骨转移过程中密切相关的骨微环境细胞因子和骨代谢调节因子

1.1 PMN的形成

PMN是由原发肿瘤释放细胞因子、生长因子和其他蛋白质因子，在远处组织创造一个能够支持转移瘤生长的环境。肿瘤细胞具备的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)能力赋予了它们迁移和侵袭的特性[6]。此外，肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP),帮助它们逃离原发肿瘤基质并进入循环[7]。同时，原发灶的肿瘤细胞能够释放外泌体、细胞因子[如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、microRNA (miRNA)]等物质。这些物质促进骨髓源性前体细胞聚集并迁移到预转移位点，从而改变和重塑未来的转移器官。这一系列的变化包括血管渗漏、炎症、免疫抑制以及细胞外基质重塑等，都有利于肿瘤细胞在这个新的生态环境定植和生长。外泌体在其中发挥重要作用，通过特异性方式将其携带的整合素与转移靶细胞融合，以引导器官特异性定植，从而促进PMN的形成[8]。

1.2 肿瘤细胞的定植和休眠

在肿瘤细胞刚刚定植时，为了在骨髓微环境中适应、生存和生长，避免被免疫系统清除，它们会通过模仿骨细胞的方式表达通常由成骨细胞或破骨细胞表达的分子和因子[如钙调神经磷酸酶(CaN)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)和IL-6等][9,10]。当肿瘤细胞遇到严苛条件，例如缺氧和低糖等环境时，它们会进入休眠状态。此时，高p38通路活性与低ERK通路活性使肿瘤细胞的增殖能力减弱，导致肿瘤细胞持续休眠，以适应骨髓微环境，避免被免疫系统清除，同时减少对药物的敏感性[11,12]。

1.3 肿瘤细胞的再激活

肿瘤细胞再激活是指在特定因素影响下，肿瘤细胞解除休眠状态并重新开始增殖。成骨细胞可以维持肿瘤细胞的休眠状态，并增强其对药物的耐药性。相反，激活破骨细胞可以重塑骨内表面的结构，释放休眠的肿瘤细胞，促使它们重新激活并开始增殖[13]。

一些源自骨内膜的外泌体中的整合素以及非编码RNA能够激活休眠状态中的肿瘤细胞，调控PMN或表达相关分子，如血管细胞黏附因子-1(VCAM-1),从而促进破骨细胞前体的招募，导致肿瘤细胞重新激活[14]。

转移相关巨噬细胞会释放趋化因子CCL3,与肿瘤细胞相互作用，通过整合素α4延长肿瘤细胞在转移部位的滞留时间，使肿瘤细胞具有破骨特性[15]。在破骨细胞的龛内，肿瘤细胞可以通过NF-κB途径被刺激，从而开始转移性生长，触发干细胞信号的释放[16]。此外，NF-κB的活化会导致抗凋亡基因的上调，并诱导细胞产生调节免疫反应的细胞因子(如TNFα、IL-1、IL-6和 IL-8)以及黏附分子，从而调控细胞的增殖和凋亡[17]。

1.4 肿瘤细胞增殖破坏骨转换平衡

骨表面的持续重塑过程，又称骨转换。肿瘤细胞的增殖会破坏骨转换平衡。当肿瘤细胞引发骨转移时，具有转移能力的肿瘤细胞会被招募到骨骼中，它们释放细胞因子并激活破骨细胞，同时抑制成骨细胞的活性，导致骨吸收增加并引起溶骨性病变。随着骨基质的分解，释放出的细胞因子进一步刺激肿瘤细胞的增殖，形成了骨骼破坏的“恶性循环”[18]。成骨细胞分泌成骨细胞衍生因子，如TGF-β、 NF-κB配体受体激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)等，这些因子在矿化骨基质中沉积，激发肿瘤细胞的转移潜能[19]。与此同时，破骨细胞分泌促破骨细胞因子，如IL-1和IL-6等，增强对旧骨的重吸收[20]。位于骨微环境中的肿瘤细胞分泌TGF-β、PTHrP和IL-6等，这些细胞因子与激素可以促进骨髓基质细胞和成骨细胞共同产生RANKL。RANKL与肿瘤源性的IL-6、IL-1共同刺激破骨细胞前体融合形成成熟的多核破骨细胞。破骨细胞的溶骨功能由于RANKL与成熟破骨细胞表面RANK的结合而被激活，从而分泌组织蛋白酶K并分解骨质胶原。由于骨转换的平衡被打破，骨内储存的生长因子TGF-β被释放出来进入骨微环境中，进一步刺激肿瘤细胞增殖和细胞因子的释放[19,20,21,22]。

在骨转换过程中，一些激素和细胞因子也参与了骨转换平衡的调节。例如，甲状旁腺激素(PTH)和PTHrP通过结合甲状旁腺激素1型受体(PTH1R)来调控破骨细胞的生成。另外，甲状腺滤泡旁“C”细胞分泌的降钙素(CT)通过作用于高亲和力降钙素受体(CTR)来干扰破骨细胞分化，抑制破骨细胞形成，减少骨吸收[23]。成骨细胞和破骨细胞的活化会释放代谢过程的酶类或代谢产物蛋白质/多肽，包括骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(OC)、脱氧吡啶啉(DPyr)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP5b)、β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTx)和总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(tP1NP)等[20]。这些激素和细胞因子可以进入血液，并有可能成为肿瘤骨转移的早期标志物。检测这些物质可以提供有关肿瘤骨转移进展的信息。

2、骨转移机制相关血清学标志物的研究进展

在肿瘤骨转移的发展过程中，伴随着与肿瘤骨转移机制相关的物质，如外泌体及其内容物、细胞增殖因子、钙磷代谢调节指标、骨形成标志物、骨吸收标志物等，进入外周血液。因此，监测这些物质在血清中的浓度变化可能成为提示肿瘤骨转移发生或进展的线索。由于血液标本获取方便、无创伤、操作简单，并且便于进行动态观察，因此研究和应用骨转移机制相关血清学标志物一直备受关注。以下将介绍这些血清学标志物在临床上的应用。

2.1 外泌体及其内容物

外泌体在肺癌骨转移PMN的形成有重要作用，其主要功能分为以下几个方面：(1)促进骨转移相关信号的传递：肺癌细胞释放的外泌体携带多种生物活性分子，包括蛋白质、核酸(如miRNA)和脂质。这些外泌体通过与骨细胞或其他微环境细胞相互作用，传递骨转移相关信号，如增强骨破坏和促进肿瘤细胞的迁移和定植[24]。(2)影响骨细胞功能：外泌体中的生物活性分子可以直接作用于骨细胞，影响其功能和表型。例如，外泌体中的miRNA可以通过调节靶基因的表达，促进骨吸收或抑制骨生成[25]。这些改变可能导致骨重塑异常，为肺癌细胞的骨转移提供有利条件。2021年YANG等人[26]的研究证实了miRNA在肺癌骨转移中的诊断价值，可作为生物标志物进行检测。该研究在与健康人群比较后发现，肺癌骨转移患者表现出独特的miRNA谱，对于肺癌骨转移的早期诊断和预后评估具有一定意义。(3)调节免疫环境：外泌体释放的生物活性分子可以影响免疫环境，包括免疫细胞的活化状态和免疫调节因子的释放。这可能导致免疫抑制和免疫逃逸，为肺癌细胞的生长和转移提供免疫保护[27,28]。(4)介导迁移和定植：外泌体中的某些分子可以促进肺癌细胞迁移和定植到骨组织。例如，外泌体中的整合素可以与肿瘤细胞表面的整合素结合，引导肺癌细胞的器官特异性迁移和定植，从而促进PMN的形成[24]。

总的来说，外泌体通过介导信号传递、影响骨细胞功能、调节免疫环境和促进迁移定植等途径，在肺癌骨转移PMN的形成中发挥着重要的调控作用。外泌体在肿瘤骨转移过程中的作用逐渐受到关注，但将其作为骨转移相关标志物的研究目前仍相对较少且尚不成熟。

2.2 骨转移相关细胞因子

在骨转移过程中，骨微环境中增殖的肿瘤细胞会分泌激素和细胞因子，如PTHrP和IL-6,这些分子能够促进骨髓基质细胞和成骨细胞合作产生RANKL,从而进一步激活破骨细胞的溶骨功能。

PTHrP在多种肿瘤的骨转移中发挥着关键作用，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌和甲状腺癌[29]。在肿瘤引发骨溶解过程中，PTHrP是一个关键分子。CHAI等人[30]的研究发现，PTHrP在小细胞肺癌的骨转移中具有显著作用，但在内脏转移中不起作用，这在一定程度上表明了PTHrP的特异性。此外，乳腺癌、前列腺癌、肺癌等实体肿瘤的骨转移中也普遍观察到PTHrP的高表达[31,32,33],KATSELI等人[33]对125例肺癌患者的PTHrP水平进行检测发现，PTHrP在肺癌患者中的表达水平明显高于健康人群，特异性为93%。

另一方面，IL-6是趋化因子家族的一种细胞因子，它通过与膜结合或可溶性受体在成骨细胞系的早期发挥作用，促进骨吸收和破骨细胞的发育[34]。IL-6能够激活多个细胞信号传导通路，包括信号转导子和转录激活子(STAT)通路、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。这些通路的激活可以解释IL-6介导正常和病理性骨重塑、炎症、细胞生存、增殖以及对肿瘤的促进作用[35]。一项研究发现，血清IL-6水平与骨转移相关，在45例骨转移患者中，血清IL-6水平显著高于无骨转移患者，灵敏度为77.78%,特异性为87.50%,这表明血清IL-6可能对肺癌骨转移早期诊断具有一定价值[36]。

2.3 钙磷代谢调节指标

在肺癌骨转移过程中，患者常出现钙磷代谢紊乱，这导致体内继发性分泌PTH和CT以调节钙磷水平[37]。

PTH是一种由甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素，在骨代谢中扮演着重要的调控角色。PTH对维持体内的钙磷平衡和骨代谢的调节至关重要。PTH通过与骨、肾等组织表面的受体结合，促使血钙水平升高，同时降低血磷水平。PTH通过硬化蛋白(SOST)和RANKL介导的机制来调控成骨细胞和破骨细胞的功能，促使成骨细胞分泌和释放诸如IL-6与IL-1等因子，从而激活破骨细胞[38]。

CT则是一种参与钙元素骨质代谢的多肽激素，其主要作用是降低破骨细胞数量以及抑制其活性，从而对骨吸收产生抑制作用[23,39]。一项涉及100例肺癌患者的临床研究发现，在肺癌骨转移的患者中，血清降钙素水平明显高于未发生骨转移的患者(P<0.01),这一发现在一定程度上表明血清降钙素水平可能对肺癌骨转移的早期诊断具有一定的价值[40]。

2.4 血清骨形成和骨吸收标志物

骨骼是一个代谢活跃的组织，每个成人每年约有10%的骨骼发生重塑，包括骨吸收和骨形成过程。在这个重塑过程中，成骨细胞和破骨细胞的活动会释放一些蛋白质、酶或肽类物质[20]。为了迅速监测骨细胞代谢的活跃程度，人们广泛使用血清和尿液检测这些生物标志物，这些标志物被归类为生化骨标志物[41]。当肿瘤细胞在骨组织中增殖时，它们可能会加速骨代谢或导致骨代谢失衡，进而改变血清生化骨标志物的水平。

2.4.1 血清骨形成标志物

血清骨形成标志物是指骨形成过程中直接或间接生成的酶、激素或代谢产物，它们在进入外周血后可以通过血清检测来评估。主要的骨形成标志物包括OC、OPG和tP1NP。

OC是由成骨细胞特异性产生，在骨中含量丰富的非胶原蛋白。OC参与了骨吸收的调节、骨基质的矿化和成骨细胞的分化过程，与骨骼的正常矿化速率密切相关[42]。在临床实践中，通过检测OC的氨基端中间片段(N-MID)来反映血清中的OC水平[43]。一项包括231例肺癌患者的临床研究发现，肺癌患者中骨转移的患者血清中的N-MID水平显著高于没有骨转移的患者，其对于肺癌骨转移患者诊断的灵敏度为77.32%,特异度为78.33%,这一发现在一定程度上提示了血清N-MID水平与肺癌骨转移可能存在相关性[44]。

OPG也被称为破骨细胞生成抑制因子。OPG主要的作用是通过OPG/RANKL系统来调节骨代谢，它与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞的分化，并促进成熟破骨细胞的凋亡[45]。研究表明，肺癌骨转移患者的血清OPG水平高于肺癌患者与健康人群，其对 肺癌骨转移患者诊断的特异性和灵敏度 分别为92.3%和62.3%,与肺癌骨转移的进展呈正相关[46]。

tP1NP是由成骨细胞合成和释放的物质，主要反映了成骨细胞生成胶原的能力。tP1NP与多种骨代谢疾病、肿瘤骨转移以及多发性骨髓瘤等密切相关。与此同时，tP1NP具有较高的特异性，受生理节律的影响较小，室温下稳定，并且其在血液中的浓度不受饮食和肾功能的影响。因此，tP1NP被视为监测成骨细胞活性和骨形成的特异性指标。研究表明，肺癌骨转移患者的血清tP1NP水平明显高于无骨转移的患者，其曲线下面积(area under the curve, AUC)值为0.874[47]。在使用tP1NP来监测肺癌骨转移的进展时，随着疾病的发展，血清中tP1NP的浓度呈逐渐上升的趋势[48]。

2.4.2 血清骨吸收标志物

血清骨吸收标志物是指在骨吸收过程中，由破骨细胞分泌的酶、激素或骨组织代谢产物进入外周血，可以在血清中检测到的标志物。这些标志物主要包括TRAP5b和β-CTx等。

TRAP5b主要由破骨细胞合成和分泌，在机体的骨代谢中起着重要作用[49]。在骨转移的过程中，破骨细胞的代谢活跃会导致大量TRAP5b合成并释放到血液中，因此血清中的TRAP5b含量升高，这使得TRAP5b成为了指示机体破骨细胞活性的重要标志物，也有助于诊断是否发生了恶性肿瘤骨转移[49,50]。CHAO等人[51]和 KOIZUMI等人[52]的研究发现，在恶性肿瘤骨转移早期阶段，即使只有微小的骨病灶，血清中TRAP5b水平也会显著升高，因此它对早期提示肿瘤细胞的骨转移具有重要价值。另外，王春娟等人[53]的研究也发现，肺癌患者合并骨转移情况下，血清TRAP5b水平明显高于未合并骨转移的患者，诊断灵敏度为73.33%,特异度为86.67%。

β-CTx是由Ⅰ型胶原降解产生的物质，它是反映破骨细胞骨吸收活性的溶骨性指标，其升高程度与破骨细胞活性的增加程度相关[54,55]。研究发现，肺癌骨转移患者的血清中β-CTx浓度明 显高于未发生 骨转移的患者，AUC值为0.776[48]。乔丹等人[56]研究认为，血清中的β-CTx是预测肺癌骨转移的有效指标，同时也对评估肺癌骨转移患者的预后具有一定价值。

骨转移机制相关血清学标志物详见表1。

表1 骨转移机制相关血清学标志物

2.5 多指标联合运用

肿瘤骨转移是一个复杂的多步骤连续事件，单一生物标志物在诊断骨转移方面的效力有限。因此，许多国内外的研究者开始研究多种指标联合检测的可行性。

应用多个骨转移相关标志物的联合检测可以提高诊断肺癌骨转移的效率。例如，TENG等人[48]研究发现，患有骨转移的肺癌患者血清中骨转换标志物(tP1NP和β-CTx)以及骨微环境中的细胞因子(CaN、OPG、PTHrP和IL-6)都显著升高。通过将这六个标志物进行多指标联合诊断，AUC 达0.939,灵敏度为85.8%,特异性为89.7%。与单一标志物相比，这六个标志物的联合应用在早期诊断肺癌骨转移方面表现出更高的诊断效率。此研究还指出，多指标联合检测可比影像学方法提前约9.46个月(范围为5.00至17.63个月)预测骨转移的发生。

传统影像学在早期诊断肺癌骨转移方面效果较差。然而，将生物标志物与传统影像学技术结合使用可以弥补传统影像学的低特异性和有限的诊断效力，进一步提高其在早期诊断肺癌骨转移方面的临床应用价值。以2020年麦家杰和陆建梅等人[57,58]的研究为例，他们采用了SPECT、CT和骨代谢标志物碱性磷酸酶(ALP)、CA联合诊断方法，得到的AUC值为0.836,敏感度为94.74%,特异度为71.43%,准确度为90.78%。与单一标志物和影像学相比，这种方法也更准确地诊断了肺癌骨转移的早期症状。

随着统计学方法的不断进步，利用多元logistic回归分析来构建多指标的疾病风险预测模型已经成为可能。ZHU等人[59]对339例肺癌患者多项生物标志物进行了 分析，包括β-CTx、tP1NP、N-MID、PTH、维生素D3( VitD3)、ALP、钙(CA)、磷(P)、细胞角蛋白19片段(F211)等指标。通过多因素logistic回归分析，他们建立了四个多元回归模型。其中，P4模型[P4=5.011+2.6×10-5×(β-CTx×tP1NP)+4.10-2×(ALP)-2.779(CA)]对于肺癌骨转移的敏感性为82.5%,特异性为72.0%。

3、总结与展望

骨转移是肺癌晚期患者常见的并发症之一，对患者的生存质量和生存期造成严重影响。早期发现和治疗骨转移对于肺癌患者的慢病化管理至关重要。从理论上来说，与影像学检查相比，与肺癌骨转移机制相关的血清学标志物可能更有潜力进行早期诊断。已有文献支持骨转移血清学标志物在肿瘤骨转移诊断中的价值[60,61]。但目前尚缺乏大规模、多中心的数据支持。因此，有必要进一步研究血清学标志物在肺癌骨转移早期诊断中的潜在作用。这包括展开更大规模的临床研究，积累更多数据，并应用先进的分析方法来评估这些标志物的临床应用价值。借助机器学习等人工智能技术，可能有助于识别和验证血清学标志物在早期骨转移诊断中的预测能力。这些研究有望提供更可靠和准确的诊断方法，有助于医生更早地发现肺癌患者的骨转移并采取相应的治疗措施。

参考文献:

[2]李卓文,王蓓,亢勇飞,等.X线､CT､MRI及ECT评价支气管肺癌骨转移的临床分析[J].影像研究与医学应用,2021,5(15):80-81.

[3]白娟,蒲萍,郑玲.小细胞肺癌发生骨转移及骨相关事件的风险因素分析[J].现代肿瘤医学,2019,27(16):2876-2879.

[11]曾刊,李鑫,汪成林,等.骨微环境相关细胞对肿瘤细胞骨转移的作用及机制[J].国际口腔医学杂志,2020,47(01):95-101.

[18]洪方正,胡若愚,薛涛.肺癌骨转移机制的研究进展[J].东南大学学报(医学版),2021,40(05):714-720.

[21]唐琼,赵辉,贾锐,等.BAP和β-CTX与肺癌骨转移进展程度的相关性[J].中国肺癌杂志,2013,16(03):144-147.

[22]瓦俄,方珏敏,许青.成骨与溶骨性骨转移机制差异及靶向药物进展[J].现代肿瘤医学,2017,25(22):3699-3703.

[24]刘子钰.LSD1通过调控外泌体miRNA分选重塑乳腺癌骨转移前微环境的机制研究[D].吉林:吉林大学,2023.LIU ZY.Study on the mechanism of LSD1 remodeling the microenvironment

[36]周健,孙昕.骨肿瘤患者血清细胞因子TNF-α和IL-6水平观察及临床意义[J].中国医药科学,2011,1(19):61-62.

[37]胡兵,孟倩.PTH､Ca､P在肿瘤骨转移判断中的变化分析[J].标记免疫分析与临床,2021,28(10):1741-1745.

[40]张仙森,解晶.肺癌骨转移患者血清降钙素与骨钙素的检测及其临床意义[J].中国慢性病预防与控制,2012,20(02):198-200.

[44]陆立,卢仁泉,孙佳俊,等.血清N-MID在原发性肺癌患者骨转移辅助诊断和疗效监测中的应用分析[J].中国癌症杂志,2021,31(09):838-844.

[46]殷金兰,陈肖燕.血清骨保护素在肺癌诊断中的临床价值[J].实验与检验医学,2009,27(01):7-9.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:81974315); 上海市科委医学创新研究专项项目(编号:20Y11903300); 上海市卫健委卫生行业临床研究青年项目(编号:20204Y0342);

文章来源:吴昀喆,滕小艳,杜玉珍.肺癌骨转移机制相关血清学标志物的研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2473-2479.