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奥沙利铂联合艾瑞昔布对裸鼠人结肠癌LOVO细胞移植瘤模型的细胞凋亡作用机制的影响

2020-08-27 306 上传者：管理员

摘要：目的探讨艾瑞昔布联合奥沙利铂对裸鼠人结肠癌LOVO细胞移植瘤模型的细胞凋亡的影响及与生存素(Survivin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase3)的关系。方法用裸鼠构建人结肠癌LOVO细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将造模成功裸鼠随机分为4组:空白对照组、艾瑞昔布组、奥沙利铂组和联合用药组,每组16只。空白对照组(0.9%NaCl);艾瑞昔布组(艾瑞昔布100mg·kg-1·d-1,灌胃,1次/天);奥沙利铂组(奥沙利铂30mg·kg-1·d-1,静脉注射,1次/周);联合用药组(艾瑞昔布组+奥沙利铂组),连续给药21d。计算瘤体体积,缺口末端标记法法检测瘤体凋亡指数(AI)%,酶联免疫吸附法检测裸鼠血清Survivin和Caspase-3浓度,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测瘤体Survivin和Caspase-3基因表达,免疫组化检测瘤体Survivin和Caspase-3蛋白表达。结果空白对照组、艾瑞昔布组、奥沙利铂组和联合用药组的瘤体体积分别为(1210±230),(953±205),(897±174)和(651±155)mm3;这4组的AI%分别为(10.35±1.52)%,(32.60±2.26)%,(40.57%±2.74)%和(55.23±3.40)%。这4组的血清Survivin浓度分别为(16.15±1.33),(13.76±1.26),(13.25±1.20)和(10.24±1.17)μg·L-1;这4组的Caspase-3浓度分别为(5.62±1.16),(13.06±1.23),(14.44±1.26)和(22.16±1.38)μg·L-1;基因和蛋白结果的趋势与血清浓度一致。上述指标:3个给药组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);艾瑞昔布组、奥沙利铂组与联合用药组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),说明联合用药组疗效最好。结论艾瑞昔布联合奥沙利铂可能通过调控Survivin、Caspase-3表达,抑制结肠癌移植瘤细胞凋亡,增强奥沙利铂的抗肿瘤效果。

关键词：
协同抗肿瘤效应
奥沙利铂
细胞凋亡
结肠癌
艾瑞昔布
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结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一[1]。奥沙利铂作为第3代新型铂类抗癌药,是消化道肿瘤的优选化疗药物[2]。环氧化酶(COX)抑制药对多种实体肿瘤的生长均有抑制作用,对多种化疗药物具有增敏作用[3]。本实验研究选择性COX-2抑制药——艾瑞昔布联合奥沙利铂对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及其机制。

材料与方法

1、材料

细胞人结肠癌LOVO细胞,购自中国医学科学院。

动物3～4周龄SPF级BALB/c裸小鼠,雌雄各半,体重(20±3)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号:SCXY(京)2018-0604。

药品与试剂注射用奥沙利铂,规格:每支0.1g,批准文号:国药准字H20000337,批号:150915;艾瑞昔布,规格:每片0.1g,批准文号:国药准字H20110041,批号:110042,均为江苏恒瑞医药股份有限公司生产。生存素和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒,购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗鼠生存素(Survivin)和Caspase-3多克隆抗体,购置于美国CST公司;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒,购自美国Invitrogen公司;原位末端转移酶标记(TUNEL)试剂盒,购自德国BoehringerMannheim公司。

仪器ABI7900实时荧光定量PCR仪,美国ABI公司产品;BX53奥林巴斯显微镜,日本OLYMPUS公司产品。

2、实验方法

2.1构建裸鼠人结肠癌移植瘤模型

参照文献[4]方法,在裸鼠颈背部皮下接种单细胞悬液0.2cell·mL-1。约2周接种部位长出粉红色质硬结节,造模成功标准:肿瘤体积≈100～300mm3,肿瘤直径≈7mm。

2.2分组和药物干预

按随机数字表法将造模成功大鼠分为4组:空白对照组、艾瑞昔布组、奥沙利铂组和联合用药组,每组16只。

空白对照组,灌胃0.9%NaCl,1次/天;艾瑞昔布组,灌胃艾瑞昔布100mg·kg-1·d-1,1次/天;奥沙利铂组,静脉注射奥沙利铂30mg·kg-1·d-1,1次/1周;联合用药组,艾瑞昔布组+奥沙利铂组,连续给药21d。

2.3计算肿瘤体积

用游标卡尺测量肿瘤最大径(a,mm)和与最大径垂直的最长径(b,mm),肿瘤的近似体积(V,mm3)=1/6πab2。

2.4组织取材

25d后,脱白法处死裸鼠,左心室采血5～10mL,以3000r·min-1离心15min,取上血清0.5～1.0mL,-20℃保存备用。剥离肿瘤组织,置于液氮备用,取部分瘤体以4%多聚甲醛溶液固定,制作石蜡切片,室温保存备用。

2.5用酶联免疫吸附法测定各组裸鼠血清Survivin、Caspase-3浓度[4]4]

取出血清,参照试剂盒说明书操作步骤,检测各组血清Survivin、Caspase-3浓度。

2.6用RT-PCR法检测Survivin和Caspase-3基因表达[5]5]

取瘤体组织50mg,提取总RNA,分析RNA纯度并调整浓度。参照逆转录试剂盒操作,用逆转录反应制备cDNA,加入相应PCR反应体系进行PCR反应。qRT-PCR扩增引物序列,由上海吉玛制药技术有限公司合成。PCR热循环仪扩增反应。以2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。

2.7用免疫组织化学染色(IHC)法检测瘤体Survivin和Caspase-3蛋白表达

取出切片,常规脱蜡,参照文献[6]方法,光学显微镜下观察染色并拍照,每片随机选取5个视野,IMAGE-PRO6.2图像分析系统分析,检测光密度(integratedopticaldensity,IOD)值。

2.8用TUNEL法检测各组瘤体细胞凋亡指数(AI)[7]7]

参照试剂盒说明书逐步操作,光学显微镜观察采集图像,细胞核呈棕褐色颗粒为阳性细胞,高倍镜下计算阳性细胞数和总细胞数,AI(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

3、统计学处理

用SPSS20.0软件进行统计分析,计量资料以x¯±s表示,2组间比较用单因素方差分析,多组间比较用SNK法。

结果

1、各组裸鼠抑瘤率比较

艾瑞昔布组、奥沙利铂组、联合用药组与空白对照组比较,瘤体均生长缓慢,抑瘤效果显著,差异均有统计学意义(均P<0.05);以联合用药组抑瘤最显著。见表1。

表1各组裸鼠瘤体体积比较

2、各组裸鼠Survivin和Caspase-3血清浓度比较

艾瑞昔布组、奥沙利铂组、联合用药组与空白对照组比较,血清Survivin浓度均显著降低、而Caspase-3显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),以联合用药组最低或最高。结果见表2。

表2各组裸鼠Survivin和Caspase-3血清浓度比较

3、各组瘤体Survivin和Caspase-3基因表达比较

艾瑞昔布组、奥沙利铂组、联合用药组与空白对照组比较,血清Survivin基因表达均显著降低、而Caspase-3显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),以联合用药组最低或最高。结果见表3。

表3各组瘤体Survivin和Caspase-3基因表达比较

4、各组瘤体Survivin和Caspase-3蛋白表达比较

艾瑞昔布组、奥沙利铂组、联合用药组与空白对照组比较,Survivin蛋白表达均显著降低、而Caspase-3显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05),以联合用药组最低或最高。与基因趋势一致,见表4。

表4各组瘤体Survivin和Caspase-3蛋白表达比较

5、各组瘤体AI%比较

空白对照组、艾瑞昔布组、奥沙利铂组和联合用药组的AI%分别为(10.35±1.52)%,(32.60±2.26)%,(40.57%±2.74)%和(55.23±3.40)%。与空白对照组比较,3个给药组均显著增高,差异均有统计学意义(均P<0.05);艾瑞昔布组、奥沙利铂组与联合用药组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),以联合用药组最高。

讨论

结直肠癌的发生发展与肿瘤细胞异常增殖、异常分化、细胞凋亡抑制有密切联系,其中细胞凋亡障碍是重要机制之一[8]。加强肿瘤细胞的凋亡能够提高化疗药物敏感性的治疗效果[9]。Survivin与Caspase-3是与细胞凋亡关系最为密切的基因之一。Survivin是较强的凋亡抑制因子,具有抑制细胞凋亡、参与细胞周期调控和促进细胞分化等多种功能[10]。Survivin通过特异性调控Caspase蛋白酶家族下游的凋亡执行因子Caspase-3和Caspase-7活性,有效阻断细胞凋亡过程[11]。

本研究结果证实,艾瑞昔布及奥沙利铂各有其独立的抗肿瘤作用,均可作为独立的促凋亡信号诱导肿瘤细胞凋亡,两药联合应用时具有协同抗肿瘤效应。其抑瘤机制可能是通过抑制抗凋亡蛋白Survivin、上调凋亡蛋白Caspase-3的表达,最终诱导细胞发生凋亡。

参考文献：

[4]王磊,陈卫昌,谢学顺,等.塞来昔布对实验性结肠癌原位移植瘤生长及血管形成的影响[J].中华肿瘤防治杂志,2006,13(17):1295-1300.

[5]王永翔,师水生,王洋,等.塞来昔布联合PDTC对人结肠癌细胞HT-29的抑制增殖和促凋亡作用及其机制[J].中国临床研究,2014,27(7):769-772.

[6]王玲婵,崔立静,王东昌,等.艾瑞昔布抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤侵袭和转移及其机制[J].中国癌症杂志,2017,27(1):1-6.

[7]孟翠翠,陈晓品,罗治彬.塞来昔布联合替吉奥对胃癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2013,29(5):458-461.

王小波,周璐瑶,周少朋.艾瑞昔布联合奥沙利铂对裸鼠人结肠癌LOVO细胞移植瘤模型的细胞凋亡作用机制研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2444-2447.