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卫矛醇对C6胶质瘤细胞体外抗癌活性及机制探讨

2024-03-01 27 上传者：管理员

摘要：目的：研究卫矛醇对C6胶质瘤细胞株的体外增殖及凋亡的影响。方法：将C6大鼠胶质瘤细胞随机分为对照组、卫矛醇干预组、卫矛醇+雷帕霉素组、卫矛醇+3-MA组，各组予不同药物孵育，采用MTT法检测卫矛醇对C6细胞的体外增殖抑制率，筛选出抑制率相对较高且生长状态良好的细胞；应用Hoechest 33342染色透射电镜观察细胞凋亡亚显微结构的改变，采用免疫荧光和Western Blot技术检测与凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。结果：卫矛醇对C6胶质瘤细胞增殖有明显的抑制作用，并呈现出良好的浓度-效应相关性，与对照组比较，随着浓度的增加，细胞的增殖抑制率上升(P<0.01);Hoechst染色结果显示，与对照组相比，共同孵育卫矛醇24 h后的C6细胞出现明显的核固缩现象，证明有大量的细胞出现凋亡；Western Blot结果显示，与对照组相比，促凋亡基因Bax表达上调，抗凋亡基因Bcl-2表达下调。结论：卫矛醇能够抑制C6细胞的增殖，并诱导其凋亡，其作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2有关。

关键词：
C6胶质瘤细胞
作用机制
卫矛醇
手术治疗
抗癌活性
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脑胶质瘤是神经外科最常见肿瘤，约占颅内肿瘤的50%以上[1]。近20年来，脑胶质瘤患者生存期无明显改善，手术、放疗、化疗、基因治疗等均难以根治[1]。目前，胶质瘤的手术治疗进展主要体现在应用相关技术，在术中实时准确的定位，以利于胶质瘤的全切除，同时减少正常脑组织的损伤。放射治疗是神经胶质瘤治疗的重要组成部分，对于手术不能彻底切除的肿瘤、术后易复发的肿瘤、深在而不易手术、肿瘤侵及重要功能区而无法手术的患者、患者全身状态不能耐受手术、肿瘤对放射线敏感的患者，可以将放疗作为首选治疗方法[4,5,6,7,8]。化学治疗是胶质瘤重要的辅助治疗方法，但是由于胶质瘤化疗耐药现象十分常见，化疗的效果并不令人满意。

卫矛醇(Dulcitol)是昆明海棠、雷公藤、美登木、南蛇藤等卫矛科植物中的成分之一，属于卫矛科的木质藤本植物的提取物[9],化学名为半乳糖醇，是甘露醇、山梨醇的同分异构体，具有功能性糖醇的性质[10]。上世纪七十年代初，美国从非洲一种名为齿叶美登木植物中找到了一种物质，经鉴定为半乳糖醇。1972年我国也发现有美登木分布，此后亦从中分离得到半乳糖醇，并以此为原料合成二溴乳糖醇(DBG)、二去水半乳糖醇(DAG)[11]等药物品种，并研制出卫矛醇的粉化剂。研究发现DBG不仅可以用于治疗脑瘤、肺癌、胃肠道肿瘤及泌尿生殖道肿瘤等实体肿瘤，对慢性粒细胞白血病也有较好疗效[12]。但由于其原料缺乏、提取工艺复杂，毒性较大，目前应用十分局限，因此寻找其高效、安全的提取物意义重大。

卫矛醇分子式为C6H14O6,是合成二去水半乳糖醇的基础原料，本课题组使用的卫矛醇是一种以玉米芯木糖醇母液为原料，经料液预处理、化糖脱色、过滤、加氢、离子交换、蒸发浓缩、真空结晶、结晶离心、干燥等工序加工制得。玉米芯在我国产量丰富，容易获取，大大降低了研究成本。本课题组前期实验研究发现，卫矛醇可以抑制大鼠C6胶质瘤细胞的生长，提高其氧化应激水平，提示卫矛醇可能是潜在的治疗脑胶质瘤的药物。目前国内外并无卫矛醇治疗肿瘤的相关报道，且其发挥保护功能的详细机制及作用的具体靶点目前还没有明确的阐述。而这些大大限制了卫矛醇在临床中的开发与应用。

本研究采用MTT法观察卫矛醇对C6胶质瘤细胞的体外增殖抑制及诱导凋亡的作用，并应用Annexin-V-FITC试剂盒结合Hoechest 33342染色的方法，利用流式细胞仪测定，细胞核形态变化由Hoechest 33342染色，采用荧光显微镜下观察计数；采用免疫荧光和Western Blot技术检测与凋亡和自噬相关蛋白的表达水平，为深入研究卫矛醇对C6胶质瘤细胞的体内外抑制作用及其分子机制提供理论依据。

1、实验材料

1.1细胞

C6大鼠胶质瘤细胞系，购自武汉益普生物科技有限公司，由本院医学实验科保存。

1.2药物及试剂

卫矛醇(四川省精粹天成药物科技有限公司)。胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清(杭州四季青公司);噻唑兰(MTT,Sigma);二甲基亚砜(DMSO,上海生工生物工程有限公司);碘化丙啶(PI)染液(Sigma);3-甲基腺嘌呤(3-MA,博奥森生物有限公司)。

2、实验方法

2.1 C6细胞的培养

细胞复苏时采用快速复温法，采用单层贴壁培养，加入适量含有10%小牛血清的DMEM培养液，置入温度37℃、5%CO2的培养箱中培养，隔日半量更换培养液，C6细胞呈成纤维细胞型贴壁生长。

2.2实验分组

将C6大鼠胶质瘤细胞随机分为对照组(control)、卫矛醇干预组(dulcitol)(药物浓度分别为1、5、10、15、20、25、50 mg/ml)、卫矛醇(25 mg/ml )+雷帕霉素组(25 ng/ml)、卫矛醇+3-MA组(5μm )。各组给予不同药物孵育。

2.3 MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节细胞密度为1×108/L接种于96孔板中，每孔100μl,无血清培养24 h,然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设6个复孔。6、12、24、48、72 h后，每孔加入5μg/L的MTT溶液20μl继续在CO2培养箱中孵育4 h,然后取出96孔培养板，弃去上清液，每孔加入150μl的DMSO,置于摇床上振荡10 min,待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度值(A490nm)。细胞存活率(%)=A490 nm (实验) /A490 nm(对照)×100%。

2.4 Hoechest 33342染色测定细胞凋亡率

采用Annexin-V-FITC试剂盒结合Hoechest 33342染色的方法。细胞药物孵育后，凋亡比例测定采用Annexin-V-FITC试剂盒利用流式细胞仪测定。细胞核形态变化由Hoechest 33342染色，采用荧光显微镜下观察计数。

2.5免疫荧光和Western Blot技术检测与凋亡和自噬相关蛋白的表达水平

使用RIPA缓冲液裂解C6胶质瘤细胞并提取蛋白质，将蛋白质进行定量、电泳分离、转膜、封闭后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，次日，将印迹与二抗在室温下孵育1 h。使用ECL试剂可视化蛋白，ImageJ软件分析蛋白质条带的灰度值。

2.6氧化应激指标水平检测

取对数生长期的细胞，经过2.5、5.0、10.0 mg/L的OHAP -1处理后，弃上清。用0.225%胰酶消化，PBS洗涤1次，2000 r/min离心10 min,弃上清。用1 ml PBS重悬，4℃超声粉碎细胞。取裂解的细胞，严格按照试剂盒操作说明并用722S分光光度计测定定MDA含量和SOD活力。

2.7统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析，所有数据表示为mean±SEM。采用单因素方差分析法分析MTT法、活性氧(ROS)产生量测定和Western Blot法测定细胞自噬水平的数据，并进行LSD检测。应用t检验分析细胞凋亡水平。为了检测组间的显著性差异，单因素方差分析(One-way ANOVA)在事后检验的支持下进行。P<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1 MTT检测结果

采用MTT方法检测肿瘤细胞増殖能力，结果显示，与空白组与对照组相比，给予不同浓度的卫矛醇提前孵育的胶质瘤细胞在24 h内，其增殖能力均受到明显抑制，差异均有统计学意义(P<0.01)。(见图1)

图1不同浓度卫矛醇对C6细胞增殖能力的影响

3.2 Hoechest 33342染色结果

与对照组相比，共孵育卫矛醇24 h后，C6细胞出现明显的核固缩现象，表明有大量的细胞出现凋亡。(见图2)

图2卫矛醇对肿瘤细胞凋亡的影响

C6细胞与卫矛醇共孵育24 h后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，与对照组相比，卫矛醇组的凋亡比率有明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。(见图3)

图3卫矛醇对肿瘤细胞凋亡的影响

3.4 Western Blot法检测结果

1)通过Western Blot法检测与细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，卫矛醇组C6胶质瘤细胞内Bax蛋白的表达明显增加(P<0.01),Bcl-xl蛋白的表达明显降低(P<0.01),细胞色素C蛋白的表达明显降低(P<0.05),表明卫矛醇可以促进肿瘤细胞的凋亡(见图4～5)。2)通过Western Blot检测与自噬相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，加入卫矛醇孵育后的C6胶质瘤细胞LC3II/LC3I水平显著降低(P<0.01),P62水平显著升高(P<0.05),表明当加入自噬的激活剂雷帕霉素后，自噬水平得到了一定程度的恢复，加入3-MA后自噬水平进一步被抑制(见图6～7)。

图4卫矛醇诱导C6胶质瘤细胞线粒体凋亡结果

图5对照组与卫矛醇组胶质瘤细胞内Bax、Bcl-xl蛋白、细胞色素C蛋白表达水平

图6卫矛醇抑制C6胶质瘤细胞的自噬作用结果

图7各组自噬相关蛋白表达水平

3.5卫矛醇对C6胶质瘤细胞氧化应激的影响

在肿瘤的发生发展过程中，需要消耗大量的氧。本研究进一步检测了C6胶质瘤细胞的氧化应激水平。结果显示，加入卫矛醇后，C6细胞的CAT和SOD的水平明显降低，丙二醛(MDA)的水平增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),说明卫矛醇在促进C6胶质细胞的凋亡可能与参与了C6胶质细胞的氧化应激水平有关；加入自噬激活剂雷帕霉素后，卫矛醇的作用受到一定的抑制，加入自噬抑制剂3-MA后细胞的氧化应激水平有进一步的提高，因此我们进一步推断卫矛醇促进C6胶质瘤细胞的凋亡可能与调节细胞的自噬水平有关。(见图8)

图8卫矛醇对C6胶质瘤细胞CAT、SOD活性和MDA水平的影响

4、讨论

在低毒高效抗癌药物筛选的研究中发现，多糖类具有很强的抗肿瘤作用，且直接来源于天然植物，正受到业界的广泛关注。卫矛醇作为一种木糖醇提取物，是抗癌药物DAG的主要基础物质，其抗肿瘤机制可能是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，干扰细胞信号传导、调节癌基因和抑癌基因的关系等实现的[10]。

肿瘤细胞扩张增殖的速度不仅依赖于肿瘤细胞增殖的速度，更依赖于肿瘤细胞消损的速度。凋亡即细胞程序化死亡是肿瘤发生消损的主要因素，已经通过动物模型和细胞培养实验验证及人类癌变组织活检进一步验证了这种现象[11]。对凋亡的抵抗是肿瘤细胞一个重要标志[12]。因此，通过不同途径诱导、增强肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤生长的有效途径[13]。本实验通过MTT检测和倒置显微镜观察发现，经过卫矛醇与C6细胞共同孵育后，C6细胞的生长被明显抑制，细胞存活率显著下降。通过流式细胞术检测不同组Annexin V和PI双阳性的细胞比率，即晚期细胞凋亡率，与对照组相比，卫矛醇组的凋亡比率有明显提高，说明卫矛醇对C6细胞的凋亡有诱导作用。

Western Blot检测结果显示，卫矛醇通过抑制C6胶质瘤细胞的自噬水平，进而影响C6胶质细胞的氧化应激水平。通过Western Blot检测与凋亡相关蛋白，结果显示，与对照组相比，卫矛醇组Bax蛋白与细胞色素C蛋白表达水平在C6胶质瘤细胞中显著下降，Bcl-xl蛋白表达水平显著升高，启动了肿瘤细胞凋亡程序，诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是由死亡受体激活，导致外源性的诱导途径，或依赖细胞色素C(cyt C)催化的线粒体的内在途径，其中Bcl-2家族蛋白成员，包括促凋亡蛋白Bax或抑制凋亡蛋白Bcl-xl可以参与线粒体的凋亡内源性途径。通过检测凋亡相关分子Bax和Bcl-xl的表达，能够明确其调控药物促凋亡的相关通路，对于卫矛醇靶向抗胶质瘤机制的理解有重要意义。

胶质瘤治疗的方向在于多学科、多措施的联合治疗。从分子机制研究胶质瘤的发生、发展过程，可以使我们对胶质瘤的发病和发展过程的了解更加深入，将有利于脑胶质瘤新的治疗方式、方法的发展和应用。针对胶质瘤的分子发病机制进行靶向治疗是目前很有希望的抗胶质瘤治疗之一，尤其是针对多靶点、多信号的治疗和联合应用放疗化疗的靶向治疗，具有更大的前景。本研究涉及的药物与通路有望成为临床治疗脑胶质瘤的重要靶点，对治疗脑胶质瘤起到积极作用，并可扩大卫矛醇的新途径。

参考文献:

[3]薛湛,李德岭,李桂林,等.影响多中心脑胶质瘤患者预后的因素分析[J].中华神经外科杂志,2017,33(3):234-238.

[4]李壮玲,李先明,钟鹤立,等.高级别脑胶质瘤放射治疗技术的研究进展[J].广东医学.2017,38(15):2403-2406.

[9]羊波,韩冰,黄萍,小春花醋酸乙酯部位的化学成分研究[J].中草药,2017,48(5):884-887.

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[11]杨锦南,李彩莲,张小毅.二乙酰二脱水卫矛醇抗瘤作用的实验研究[J]新乡医学院学报,2002,19(3):178-180.

基金资助:天津市卫生健康委中医､中西医结合科研项目(2023123);第二批卫生健康行业高层次人才选拔培养工程(TJSJMYXYC-D2-057);

文章来源:张玉岭,张涛,陈宝贵等.卫矛醇对C6胶质瘤细胞体外抗癌活性及机制探讨[J].湖南中医杂志,2024,40(02):168-172+200.