肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因[1]。2020年，全球约有90.6万新增肝癌病例，同时83万人死于肝癌[2]。2023年肝细胞癌及肝胆管癌新发病例41 210人，其中男性 27 980人，女性 13 230人，死亡 29 380人，其中男性19 000人，女性10 380 人，肝癌的 5年相对生存率(21%)也是较低的[3]。肝细胞癌已成为一个重大的全球健康问题[4]。由于患者早期无症状，导致诊断延迟，临床确诊时，疾病已经发展到严重的侵袭性阶段，严重影响了患者的生存期。此外，肝癌对化疗等常规癌症治疗有明显的耐药性。当早期诊断且肿瘤大小<5 cm时，手术切除是肝细胞癌的治疗首选[5]。然而，大多数患者都处于晚期，晚期肝细胞癌采用射频消融(radio frequency ablation, RFA)、放射性栓塞(Y90)、经动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)、立体定向身体放射治疗(stereotactic body radiation therapy, SBRT)等方法进行治疗，但是这些治疗方法侧重于局部疾病控制，没有显著延长患者寿命[6]。本文旨在通过对Oleandrin的作用与机制研究，为肝细胞癌寻找潜在的有效和安全的治疗方法，从而提高总生存和无复发生存率。

Oleandrin是一种脂溶性心脏糖苷，可以有效抑制各种癌细胞的增殖并诱导凋亡[7]。有报道，低浓度Oleandrin通过阻滞结肠癌细胞G2/M期来抑制细胞增殖[8]。Oleandrin诱导细胞凋亡主要通过以下机制进行：激活caspases、活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累/氧化应激、Bax表达升高、细胞色素C释放、激活死亡受体4和5、Bcl-2表达降低、抑制COX-2、激活Fas和Fas配体[9]。Na+/K+-ATP酶泵是肿瘤学研究的热点，它在信号转导、pH维持和细胞内碱化诱导中具有多种作用[10,11]。Oleandrin作为Na+/K+-ATP酶泵抑制剂，通过降低其水平抑制癌症细胞的增殖，增强ROS生成引起的线粒体损伤，激活caspase-3、导致肿瘤细胞凋亡和激活G2/M期DNA损伤检查点[7]。本课题组前期研究已证明，Oleandrin主要通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP途径诱导内质网应激(endoplasmic reticulum, ER)相关的胱天蛋白酶非依赖性免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)从而抑制乳腺癌细胞增殖[12]。然而，Oleandrin在肝癌中的抗肿瘤作用与机制尚不清楚，为了给肝癌治疗提供更有效的方法，我们对Oleandrin进行了进一步研究。

在对肝癌细胞系HepG2和HuH-7的研究中，我们发现，小剂量的Oleandrin作用细胞后，发现了CRT向细胞膜翻转，同时我们检测到HMGB1蛋白释放和ATP的分泌，表明Oleandrin引起肝癌细胞系ICD,进一步我们发现其与内质网应激通路被激活相关。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人肝癌细胞系HuH-7、HepG2和肝细胞THLE-2均购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂

Oleandrin (MedChem Express, HY-13719)、 MEM培养基(Hyclone, SH30024.01)、DMEM培养基(Hyclone, SH30022.01)、THLE-2完全培养基(富衡生物，FH-THLE-2)、 胰酶(Hyclone, S2130042.02)、 PBS(Hyclone, SH30256.01)、胎牛血清(Gibco, 1428478)、HMGB1 ELISA试剂盒(Signalway Antibody, EK1714)、CCK8(DojinDo, ER752)、ATP检测试剂盒(碧云天， S0026)、Alexa Fluor 488山羊抗兔 (Abcam, ab150077)、ECL化学发光试剂盒(Thermo scientific, #34087)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，P0012S)、兔抗calreticulin抗体(Abcam, ab2907)、兔抗PERK抗体(Abcam, ab79483)、小鼠抗eIF2α抗体(Abcam, ab5369)、兔抗p-PERK(phospho Thr982)抗体(Cell singaling technology, #3179)、兔抗p-eIF2α(phospho S52)抗体(Abcam, ab227593)、小鼠抗β-actin 抗体(Cell singaling technology, #3700)。

1.2 仪器

多功能酶标仪(TECAN),流式细胞仪(BD公司),蛋白转印免疫印迹成像系统(Bio-Rad),电泳转膜仪(Bio-Rad),激光共聚焦显微镜(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人肝癌HuH-7和HepG2细胞系分别以含10%胎牛血清的DMEM和MEM培养基在37 ℃,5%CO2条件下培养。人肝细胞THLE-2以THLE-2完全培养基在37 ℃,5%CO2条件下培养。根据细胞生长情况适时更换培养基和传代。换液时弃去原有培养基，适量PBS清洗1遍，加入适量新鲜培养基继续培养。传代时弃去原培养基，适量 PBS清洗1遍，0.25%胰蛋白酶消化，镜下观察细胞形态变化，适时弃去胰酶，加入培养基吹打，传代至新细胞培养瓶中继续培养。

1.3.2 细胞存活率检测与分析

按照CCK8说明书操作。取对数生长期的HuH-7、HepG2和THLE-2细胞按1×104/mL接种于96孔板中，每孔接种200 μL,于37 ℃,5%CO2条件下培养24 h。细胞贴壁后，分别以2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L、16 nmol/L、32 nmol/L等浓度加入Oleandrin, 每孔重复3次，并设置不加Oleandrin的空白对照组。继续培养24 h后，每孔加入10 μL的CCK8工作液，避光孵育2 h, 用酶标仪检测各组待检样品在450 nm处的吸光度。

1.3.3 免疫染色检测细胞CRT表达

处于对数生长期HuH-7和HepG2细胞调整浓度为5×104/mL细胞悬液，接种2 mL于预先铺好玻璃片的6孔板中，于37 ℃,5%CO2条件下培养24 h, 细胞贴壁后，以两组细胞24 h IC50浓度加入Oleandrin作用6 h。药物作用6 h后，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100的PBS溶液打孔。兔抗人源CRT抗体按1∶75稀释，4 ℃孵育过夜，Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体按1∶200稀释，室温避光孵育30 min。浓度为10 μg/mL的Hoechst33342工作液，500 μL室温避光孵育5 min, PBS洗涤4次。共聚焦显微镜下观察细胞CRT表达情况和亚细胞定位，以Image J软件分析荧光强度变化。

1.3.4 流式细胞术检测细胞CRT表达

取对数生长期HuH-7和HepG2细胞，分别以两组细胞24 h IC50浓度加入Oleandrin作用6 h, 在10%FBS封闭条件下，以1∶100稀释兔抗人源CRT抗体4 ℃孵育1 h, 2%FBS的PBS洗涤后，以1∶2 000 Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体4 ℃避光孵育30 min。以300 μL PBS重悬细胞，加入5 μL PI染料，利用流式细胞仪检测CRT表达水平。

1.3.5 ELISA检测上清HMGB1表达

取对数生长期的HuH-7和HepG2细胞按1×104/mL接种于96孔板中，每孔接种200 μL,于37 ℃,5%CO2条件下培养24 h。细胞贴壁后，以两组细胞24 h IC50浓度加入Oleandrin作用于细胞。于各个时间点收集细胞上清，用酶标仪检测各组待检样品不同时间点在450 nm处的吸光度。

1.3.6 化学发光法检测ATP分泌

取对数生长期的HuH-7和HepG2细胞按1×104/mL接种于96孔板中，每孔接种200 μL,于37 ℃,5%CO2条件下培养24 h。待细胞贴壁，以细胞24 h IC50浓度加入Oleandrin。于不同时间点收集细胞上清，加100 μL ATP检测工作液到检测孔中，室温静置5 min。将检测板移至冰上操作，加入样品100 μL,混匀2 s, 荧光分光光度计检测。

1.3.7 Western blot法检测蛋白表达

收集药物作用的细胞，提取蛋白，检测蛋白浓度，进行电泳，转膜，封闭。预冷的PBS洗涤2次，2%BSA配置一抗稀释液，β-actin按照1∶1 000稀释；PERK按照1∶500稀释；PERK(phospho Thr982)按照1∶1 000稀释；eIF2α按照1∶500稀释；eIF2α(phospho S52)按照1∶1 000稀释；4 ℃孵育过夜。预冷的TBST洗涤5次，按相应比例稀释二抗，室温摇床孵育2 h。预冷的TBST洗涤5次，于凝胶成像系统下化学发光法成像，拍照。

1.4 统计学分析

所有实验均独立进行3次，实验数据采用Graphpad Prim 7 软件进行分析，结果以平均数±标准差的形式表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Oleandrin 对肝癌细胞存活率的影响

分别以0、2、4、8、16和32 nmol/L浓度Oleandrin处理肝癌细胞以及正常肝细胞THLE-2细胞24 h, 以CCK8法检测各实验组细胞存活率。结果显示，Oleandrin对HepG2的抑制率的均值分别为0、6.64%、31.67%、42.21%、55.75%和69.00%, 对HuH-7抑制率分别为 0、5.11%、23.52%、30.69%、50.94%和82.36%。而对正常的肝细胞THLE-2细胞的抑制率相较于肝癌细胞明显降低，表明Oleandrin对正常肝细胞的毒性较肝癌细胞减弱，具备明显杀伤肝癌细胞的能力。Oleandrin在HepG2和HuH-7细胞中的24 h IC50分别为12.28 nmol/L和13.33 nmol/L。上述结果表明，Oleandrin对肝癌细胞的增殖具有明显抑制作用且具有浓度依赖性(图1)。

图1 Oleandrin在0、2、4、8、16和32 nmol/L浓度条件下分别对HepG2和HuH-7细胞以及正常肝细胞THLE-2的24 h抑制率   

2.2 免疫荧光检测Oleandrin诱导肝癌细胞CRT翻转

免疫荧光法检测CRT在肝癌细胞内的表达及亚细胞定位。我们在对照组细胞中观察到CRT主要表达在细胞质内，而加入Oleandrin作用细胞6 h后，大部分细胞中CRT由胞质翻转至细胞膜表面(图2),在HepG2与HuH-7两种细胞中均观察到这一现象，荧光定量分析结果显示，CRT在胞浆与胞膜中的表达有统计学差异(P<0.001)。

图2 Oleandrin在IC50条件下对HepG2和HuH-7细胞作用6 h后，CRT表达的亚细胞定位情况(***代表P<0.001)  

2.3 流式细胞术检测Oleandrin增加肝癌细胞细胞膜CRT表达

为进一步明确Oleandrin对肝癌细胞内CRT表达的影响，应用流式细胞术检测CRT在细胞膜表面的表达水平。为排除死细胞对CRT荧光表达造成的影响，应用PI染色，并去掉PI染色阳性细胞，排除死亡细胞膜通透性变化影响。如图3所示，Oleandrin作用于肝癌细胞后，细胞表面CRT表达平均荧光强度增强。该结果进一步证明，Oleandrin诱导肝癌细胞CRT从细胞质翻转至细胞膜。

图3 流式细胞术检测Oleandrin诱导肝癌细胞CRT表达   

2.4 Oleandrin诱导肝癌细胞HMGB1的释放

为明确Oleandrin是否具有诱导肝癌细胞HMGB1释放的作用，采用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1的表达。分别以24 h IC50浓度Oleandrin作用于HepG2和HuH-7细胞，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h时间点收集培养上清，检测HMGB1的表达。结果显示，随着Oleandrin作用时间的延长，HMGB1在HepG2和HuH-7细胞中的分泌均逐渐增加。在6 h时即可检测到HMGB1的释放，HepG2组为(0.906±0.104)ng/L,HuH-7组为(0.796±0.016)ng/L;48 h释放量明显增加，HepG2组为(1.210±0.013)ng/L,HuH-7组为(1.131±0.016)ng/L;72 h释放量最高，HepG2组为(1.599±0.021)ng/L,HuH-7组为(1.309±0.016)ng/L,与0 h相比差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果表明，Oleandrin能够诱导肝癌细胞系HMGB1释放(图4)。

图4 ELISA检测Oleandrin诱导肝癌细胞HMGB1的释放(**P<0.01)  

2.5 Oleandrin诱导肝癌细胞ATP的分泌

检测细胞培养上清中ATP表达。以24 h IC50浓度的Oleandrin作用于两组肝癌细胞，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h各个时间点收集培养上清液，检测培养上清液中ATP的表达。HepG2组各时间点结果为：0 h(1.25±0.03)μmol/L、6 h(8.44±0.78)μmol/L、12 h(15.78±0.22)μmol/L、24 h(25.59±1.14)μmol/L、48 h(19.59±1.08)μmol/L;HuH-7组为：0 h(1.58±0.04)μmol/L、6 h(12.48±1.03)μmol/L、12 h(18.86±0.44)μmol/L、24 h(28.12±0.47)μmol/L、48 h(24.04±0.15)μmol/L。从药物作用6 h开始，即可检测到上清中ATP的表达， 与0 h相比差异有统计学 意义(P<0.01)。在24 h时ATP的表达达到峰值。该结果表明，Oleandrin能够诱导肝癌细胞系ATP分泌(图5)。

图5 化学发光法检测Oleandrin诱导肝癌细胞ATP的分泌(**P<0.01)   

2.6 Oleandrin对肝癌细胞内质网应激通路的影响

起始刺激因素诱导细胞发生死亡，使死亡的细胞具有免疫原性，可以进一步激活机体适应性免疫反应，这种死亡方式称为免疫原性死亡(ICD)。为进一步探讨Oleandrin诱导肝癌细胞发生ICD的机制，通过Western blot检测Oleandrin作用于HepG2与HuH-7细胞6 h时内质网应激通路相关蛋白表达情况。结果显示，Oleandrin作用后PERK的表达水平没有变化，Oleandrin使p-PERK(Thr982)表达增加，进一步使下游eIF2α、p-eIF2α(S52)上调。证明Oleandrin作用于HepG2与HuH-7细胞6 h时后就使内质网应激通路激活(图6)。

图6 Western blot方法检测Oleandrin对肝癌细胞内质网应激通路的影响   

3、讨论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)作为最常见、最致命的癌症之一，其治疗方案十分有限[13]。HCC的主要治疗方式为手术治疗及化疗[14,15]。尽管近年HCC的化疗疗效有所改善，但由于复发率高，HCC患者的平均5年生存率仍然很低。刺激固有免疫、诱导连续免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境，平衡机体免疫反应已成为癌症治疗的发展方向。临床治疗中免疫疗法和化疗的结合已被认为是HCC治疗的综合疗法[16]。

免疫系统消除肿瘤细胞最重要的基础是肿瘤细胞要有足够的免疫原性，这主要取决于肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen, TSA)的数量。免疫原性低的(冷)肿瘤与免疫原性高的(热)肿瘤相比，冷肿瘤的癌症免疫治疗临床受益非常有限[17]。免疫原性细胞死亡作为一种特殊的细胞凋亡形式，使宿主能够触发针对死亡细胞相关抗原的特异性免疫反应。ICD依赖于一系列损伤相关模式分子(DAMPs)的表达和释放，包括细胞膜上的内质网伴侣钙网蛋白(CRT)暴露，三磷酸腺苷(ATP)分泌和高迁移率族蛋白1(HMGB1)释放[18]。这些DAMP可以直接结合并激活树突细胞(DC),将T细胞吸引到肿瘤微环境中刺激抗肿瘤免疫[19]。ICD效应也可以使癌症细胞成为“治疗性疫苗”,无需任何佐剂即可诱导抗肿瘤免疫[20]。

本次研究中，我们发现Oleandrin可以引起ICD,同时会引起肝癌细胞 ATP、HMGB1的释放及CRT的膜转位。经 Oleandrin处理的细胞内质网应激信号通路相关蛋白磷酸化PERK、eIF2α和磷酸化eIF2α蛋白表达水平显著上调，说明内质网应激信号通路在 Oleandrin诱导肝癌细胞ICD过程中发挥着重要作用。Oleandrin作用肝癌细胞引起的一系列反应，可以增加肝癌细胞的免疫原性，从而使机体免疫系统激活抗肿瘤免疫，减少肝癌细胞免疫逃逸的潜力，为临床肝癌免疫治疗方面提供一定的理论基础。

本研究阐述了Oleandrin诱导肝癌细胞免疫原性细胞死亡及潜在的分子机制，为基于Oleandrin的肝癌免疫治疗提供分子生物学证据。

文章来源:苏楠,高晓馨,陈诗,等.Oleandrin诱导肝癌细胞免疫原性细胞死亡[J].现代肿瘤医学,2024,32(10):1787-1791.